杨凌区紫花苜蓿叶枯病病原分离鉴定及其生物学特性

梁嘉俊， 李芳红， 高鸿鹏， 赵文睿， 焦 锋

(西北农林科技大学动物科技学院， 陕西 杨凌712100)

苜蓿(MedicagoSativa)是世界上种植面积最广、最重要的一种多年生豆科牧草，其具有粗蛋白含量高，产量高的特点，有“牧草之王”之称[1]。随着苜蓿种植面积的进一步扩大，苜蓿病害逐渐成为影响苜蓿产量、品质、限制苜蓿广泛应用的主要因素。据不完全统计，全世界每年因牧草病虫害造成的牧草生产损失高达35%以上，其中由病害造成的苜蓿减产就在20%以上，病害严重情况下甚至会将整块苜蓿地全部毁坏[2]。

立枯丝核菌是一种世界性广泛传播，属无孢科(Agonomycetaceae)、丝核菌属(Rhizoctonia)半知菌真菌，引起寄主植物叶枯和根腐等症状，被认为是最具破坏力的植物病原菌之一[3]。立枯丝核菌可引起根腐、茎腐、立枯及叶枯病害的植物包括马铃薯(Solanumtuberosum)[4]、水稻(Oryzasativa)[5]、玉米(Zeamays)、沙打旺(Astragalusadsurgen)[6]等。李克梅[7]在新疆苜蓿立枯丝核菌根腐病调查中发现，几乎南北疆各苜蓿种植区都有此病害发生；郭玉霞[8]在豫中平原紫花苜蓿病原真菌调查中发现，春、夏、秋3个季节立枯丝核菌均有发生；陈雅君[9]在黑龙江紫花苜蓿种植区的8个地市县病害调查，致病菌的优势种为镰刀菌、丝核菌。

由于立枯丝核菌不产生孢子，通常以菌丝融合反应对其进行融合群(anastomosis group，AG)的划分[10]。但是使用融合群对立枯丝核菌进行鉴定需要大量标准菌株，多数研究者不具备如此条件，随着分子生物学技术的迅速发展，逐步形成一套从基因水平上分析各微生物种之间亲缘关系的分类鉴定技术与方法，且相较于传统方法更为快速、准确[11]。核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)有非常丰富的遗传变异，常用来研究真菌物种分类鉴定[12]。例如，淮稳霞[13]使用rDNA-ITS序列分析方法鉴定坪褐斑立枯丝核病菌的融合群类型并探讨其系统发育关系；苗国辉[14]采用形态特征观察、致病性测定及rDNA-ITS序列分析方法鉴定出天津、黑龙江两地大白菜褐斑病病原菌为立枯丝核菌。

目前国内对紫花苜蓿立枯丝核菌病害的研究主要集中在新疆苜蓿根腐病方面[7,15-16]，陕西苜蓿种植区未见立枯丝核菌为致病菌的报道，本试验对苜蓿叶枯病的病原菌进行鉴定，同时对其生物学特性进行研究，以期为该病害的发生、防治提供理论支持。

基于机械创新设计大赛的卓越工程师培养模式是一种全新工程师培养模式的探索，它基于大学生机械创新设计大赛这个学科竞赛，其目的不仅仅局限于只是比赛，而是要以赛促教、以赛促学。在这种培养模式中，卓越工程师是培养的目的、方向，学科竞赛是途径与方法，两者互为动力，缺一不可。概括起来有以下几方面：

1 材料与方法

1.1 病样采集及病原菌分离纯化

2017年7月于陕西省杨凌区采集紫花苜蓿叶枯病样本。按照常规组织分离法[17]分离培养，待菌丝长出后根据菌落特征分离纯化，单一菌株再接入PDA培养基中扩大培养，并移入PDA斜面培养基4℃保存备用。

由于乙二醇机组的温度控制存在较大的非线性、参数时变性和模型不确定性等因素，普通PID控制器难以获得很好的控制效果，所以决定采用模糊PID控制来解决这个问题。

1.2 病菌形态及显微观察

假设在我国上市公司治理中，存在利益相关者甲和利益相关者乙，关于甲和乙诚信问题的囚徒困境博弈如图3所示。

[论文集] 序号 作者.题名[C]//编著者.论文集名.出版地：出版者，出版年：起止页码.[学位论文] 序号 作者．题名[D].保存地点：保存单位，年份：起止页码.

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1.3 菌株基因组DNA提取及ITS序列PCR扩增

先在9.5 cm规格培养皿中放入两层滤纸，0.5%吐温-20处理后用脱脂棉包裹叶柄保湿，选取苜蓿植株上长势良好无创伤的相邻三个复叶为一个接种处理，每个培养皿中放入3片苜蓿复叶。用打孔器分别取若干3 mm菌饼，每个单叶上放1个菌饼，重复数为5，加入无菌水覆盖培养皿底部。同时设空白无菌饼为对照，接种2 d后从叶片上取走菌饼，防止叶片细胞呼吸受阻死亡而使叶片变黄影响观察，一周后观察叶片发病情况并拍照统计。

1.4 病原菌ITS序列分析

测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，然后使用MEGA7.0软件进行序列间对比分析，构建分子系统树，分析各菌株间同源性。

将菌株接于PDA平板于25℃黑暗培养一周后，观察并记录菌落特征；光学显微镜观察并记录菌丝结构、分支和隔膜的有无等显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定。

1.5 菌株致病性试验

1.5.1离体叶片致病性测定 接种对象选用在温室培养一月后无病的阿尔冈金紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Algonquin’)的叶片，接种前，先用自来水冲叶片表面，然后用0.5%的吐温-20完全浸泡叶片5～10 s至叶片表面无气泡。接种方法采用菌饼法接种(菌饼直径约3 mm)，并分别设空白对照。

按照刘丽[18]的方法提取待测菌株DNA。采用真菌rDNA-ITS基因通用引物ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[19]。PCR扩增体系：2×Taq PCR MaterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(对照加1 μL双蒸水)，最后用双蒸水补足至25 μL。ITS基因PCR扩增程序:94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测以后，委托西安擎科泽西生物科技有限公司进行序列测定，并将测得序列提交Genbank注册登记。

1.5.2活体接种致病性测定 将阿尔冈金紫花苜蓿种子用70%乙醇表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，晾干后播种于装有灭菌基质土的直径12 cm塑料花盆中，每盆播种15粒种子，置于25℃、相对湿度60%、光照16 h、黑暗8 h人工气候箱中培养。

用Mega7.0 软件进行多序列比对，采用K2模型，分别用邻接法(NJ)构建rDNA-ITS序列的系统进化树(图4)。

1.6 病原菌的生物学特性

1.6.1不同光照处理对病原菌菌丝生长的影响 将供试菌株接种于PDA平板培养基活化培养后，选取单菌落用以灭菌的打孔器从菌落边缘切取4 mm直径的菌饼，接种至新鲜的PDA平板中央，各处理重复3个培养皿。并分别放置于全黑暗、全光照、12 h光暗交替三种光照条件下，25 ℃恒温培养3 d后，用游标卡尺采用十字交叉法测量菌落的生长直径。

1.6.2不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 以Czapek培养基[17]作为基本培养基，并分别用相同质量的果糖、葡萄糖、淀粉代替培养液中的蔗糖作为不同碳源，最后在每升培养液中加入17 g琼脂配制成含不同碳源的培养基，并以不加碳源、补加2 g·L-1NaCl的培养基作为对照；将4 mm直径的病原菌菌饼接入各培养基平板中央，各处理重复3个培养皿。25 ℃恒温培养3 d，按照1.6.1方法测定。

1.6.3不同氮源对病原菌菌丝生长影响 以Czapek培养基作为基本培养基，分别以相同质量的硝酸钾、硝酸铵、硝酸钠和牛肉膏代替培养基中的NaNO3，同时以不加氮源、补加2 g·L-1NaCl的培养基作为对照；取直径为4 mm菌饼置于各培养基中央，各处理重复3个培养皿。置于25 ℃恒温培养3 d后，按照1.6.1方法测定。

1.6.4不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 以浓度为0.1 M的NaOH与0.1 M的HCl将加热融解完全后的PDA培养基的pH值分别调至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0共5个梯度，高温灭菌后倒入培养皿，并将直径为4 mm的菌饼接入不同pH值的PDA平板中央，各处理重复3个培养皿。25 ℃恒温培养3 d后，按照1.6.1方法测定。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿叶枯病症状

该病原真菌生长迅速，在PDA培养基上25℃ 培养3天可长满整个培养皿,菌落呈白色至浅褐色平铺于培养基上。菌丝绒毛状,呈放射分布。菌落中央产生白色至褐色菌核，背面呈深褐色(图2A，B)。显微形态：菌丝体较粗大，初为无色，后呈淡黄褐色至褐色，直径7～10 μm，分支呈直角，分支处缢缩，附近形成隔膜(图2 C，D)。

图1 紫花苜蓿叶枯病发病症状Fig.1 The symptoms of Medicago sativa leaf blight disease

2.2 病原菌菌落及显微镜照片

发病初期叶面出现形状不规则的褐色病斑，病斑边缘叶面枯黄，逐渐扩大，病组织呈水渍状崩解腐烂。死亡组织呈深褐色至黑色，叶面干枯皱缩(图1A，B)。

测序结果分析表明其序列总长度为573 bp，G+C含量为55.67%，将序列上传至NCBI数据库，得GenBank登录号为：MH014991，病原菌序列与GenBank中已有的序列进行核酸BLAST比对分析，得到与Genebank中已有序列同源性较高的菌种信息，选取立枯丝核菌不同融合群的模式菌株用于系统发育分析(表1)。

图2 紫花苜蓿叶枯病病原形态特征Fig.2 The pathogen morphological characteristics of alfalfa leaf blight disease

2.3 分子生物学鉴定

将所提取出的病原菌DNA作为模板，用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4做PCR扩增，产物经5 μL点样电泳后进行EB染色，在紫外凝胶成像系统下拍照如图，条带单一较亮，且无非特异性扩增条带，分子量在500～750 bp之间(图3)。

根据以上对病根症状及病原菌形态学的观察，参考《真菌分类鉴定手册》[20]，鉴定病原菌属半知菌亚门，无孢目，丝核菌属(Rhizoctonia.)。

接种液配制：接种菌株于PDA平板两周后，刮取菌丝，使用0.5%吐温-20无菌水配制成0.01 g·ml-1接种液。选取培养30d后长势相同的苜蓿植株，使用喷雾器将接种液平均喷施于健康苜蓿植株上，对照组接种0.5%吐温-20无菌水，之后正常温室管理，2周后观察发病状况并记录拍照。

图3 PCR扩增产物电泳图Fig.3 The agarose gel electrophoresis of DNA products amplified by PCRM：DL2000 DNA marker；1：样本泳道Sample；CK：阴性对照Negative control

分析rDNA-ITS序列构建系统进化树，分支上侧数字为大于50%的Bootstrap检验值(1000次重复)，结果表明：在遗传距离为0.05，Bootstrap为1 000次检验时，病原菌rDNA-ITS序列seq与R.solaniAG1，IA(AB000017.1)序列的置信度为98，说明本试验研究的苜蓿叶枯病病原菌为立枯丝核菌(R.solani)AG1，IA融合群。

表1 用于系统发育树分析的相关菌株Table1 Related strains usedn phylogenetic analysis

图4 基于rDNA-ITS序列的NJ树Fig.4 The NJ tree of rDNA-ITS sequence

2.4 致病性测定

2.4.1病原菌离体叶片接种 接种2 d后开始出现明显症状(图5A)，接种叶片上具有不规则的褐色病斑，斑点周围有少许退绿现象，接种一周后(图5B，C)，病斑大面积存在于叶面。发病症状与田间发病症状相似，而对照组没有出现任何发病现象。通过统计菌饼接种法接种的27片复叶，浸染成功叶片数为17，发病率为62.96%。

2.4.2活体接种法 采用孢子悬浮液对健康的紫花苜蓿植株进行活体接种2周后进行病情统计：根部的侧根褐化、腐烂，部分根毛脱落(图6A)，叶部出现大小不等的深褐色病斑，病斑边缘枯黄，部分叶片直接褪绿变黄(图6B)。发病症状于田间采样的病株症状基本相同，本试验所分离的菌株亦可引起苜蓿植株根部病变，而对照组则没有任何发病现象(图6C)。

综上对病原菌致病性的试验结果，并分别对离体叶片接种和活体接种处理组发病叶片进行病原菌分离、纯化培养，得到与原接种所用相同病原菌，分离率为100%。根据科赫氏法则，可说明本试验研究的病原菌是具有致病性的立枯丝核菌(R.solani)。

2.5 病原真菌的生物学特性研究

2.5.1不同光照条件对病原真菌菌丝生长的影响 不同光照条件下对立枯丝核菌的菌丝生长稍有差异,黑暗条件下菌丝生长优于其他条件，但与光暗交替条件下菌丝的生长差异不显著(表2)。

图5 菌饼法离体叶片接种结果Fig.5 The results of inoculated with fungal block

图6 紫花苜蓿活体接种后发病情况Fig.6 The incidence of Alfalfa after inoculation in vivo

表2 光照对病原菌生长的影响Table 2 The effect of light on the growth of pathogenic

注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后相同字母表示经LSD法检验P=0.05水平差异不显著

Note:Values represent the means±SD of three replicates. The same letters in the same row are not significant different according to the least significant difference test (P=0.05)

2.5.2不同pH对病原真菌菌丝生长的影响 pH对于立枯丝核菌的菌丝生长无明显影响，pH在6.0～9.0时，菌株菌丝生长均表现良好，无显著差异(P<0.05)，但在pH值为7时，菌丝生长最优(图7)。

图7 pH对病原菌生长的影响Fig.7 The effect of pH on the growth of the pathogen

2.5.3不同碳源对病原真菌菌丝生长的影响 供试病原菌对供试碳源的利用情况存在一定的差异，但在不同碳源及无碳对照组CK中均能生长。立枯丝核菌菌丝在含可溶性淀粉的培养基上生长最好，在含果糖的培养基中生长最差，且差异性显著。在其他3种不同碳源培养基中，立枯丝核菌菌丝的生长差异明显，表现为蔗糖>葡萄糖>果糖。在无碳对照CK培养基上，菌丝生长最慢且极其稀疏，不利于病原菌的生长(表4)。

基于双语平行语料库的翻译研究在国内取得了一些成果(柯飞，2003，2005；秦洪武，2005，2009；徐欣，2010)，为后人研究提供了一套较为成熟的研究思路和方法。本研究通过运用自建的汉英多译本平行语料库对同一篇中文小说的五位不同英译者的翻译文本进行对比分析，定量反映不同译者文本的词汇密度/丰富度、用词偏好、句法特征等，揭示译文的独特性和共同特征。

表4 不同碳源对病原菌生长的影响Table 4 The effect of different C-source on growth of pathogenic

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

Note:Different letters in same row indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.5.3不同氮源对病原真菌菌丝生长的影响 立枯丝核菌在不同氮源培养基中菌丝生长具有显著差异(P<0.05)。立枯丝核菌在不同氮源的培养基及无氮对照培养基(CK)中均能生长并产生气生菌丝，但不添加氮源时菌丝十分稀疏。相比之下，氮源为硝酸钾最利于立枯丝核菌的生长，其次是硝酸钠与牛肉膏，而硝酸铵对立枯丝核菌生长的促进作用最小，但这四种氮源对于立枯丝核菌在培养基上的生长特性均没有特别明显的影响(表5)。

3 讨论

通过对陕西省杨凌区紫花苜蓿叶枯病田间调查、病样采集、病原菌室内分离鉴定、致病性测定，确定了导致杨凌地区紫花苜蓿叶枯病的致病菌为立枯丝核菌，通过rDNA-ITS序列分析确定了紫花苜蓿叶枯病病原菌为AG1，IA融合群，GenBank登录号为：MH014991。

表5 不同氮源对病原菌生长的影响Table 5 The effect of different C-source on growth of the pathogen

有研究指出立枯丝核菌中AG1类群可引起多种植物地上部分及叶脉的枯萎；AG2引起十字花科作物的根腐；AG4引起豆科作物的根腐[21]。在以往的研究中，立枯丝核菌主要是引起紫花苜蓿根腐病的重要病原菌[7-9,15]，李克梅[7]指出新疆苜蓿立枯丝核菌菌丝融合群有AG1，AG2，AG4，AG5 4种类型，其中AG2和AG4是优势融合群，与本试验从叶部病样分离鉴定的立枯丝核菌菌丝融合群AG1,IA有所差异，虽然在活体致病性测定中，本试验分离的菌株也表现对苜蓿根部侵染的能力(图6A)。立枯丝核菌作为一种寄主范围较为广泛的致病菌，在不同地域情况下，对相同寄主寄生的立枯丝核菌类群表现出一定的地域特异性。伍恩宇[22]报道陕西周至马铃薯立枯丝核菌菌丝融合群有AG-4，AG-5两种类型；陕西草坪草立枯丝核菌菌丝融合群有AG1-1A，AF1-1B，AG2-2ⅢB，AG2-2Ⅳ，AG5 5种类型[23]。陕西苜蓿立枯丝核菌菌丝融合群与陕西其他植物各有差异，说明菌丝融合群对寄主植物种类具有一定的选择性。

苜蓿叶枯病菌在pH值为5.0～9.0的范围内生长良好，以pH值为7.0最适合生长，说明酸性环境下不利于该菌生长，这与台莲梅[24]的研究马铃薯立枯丝核菌最适pH值为7.0的结果一致，与路小琴[25]报道马铃薯立枯丝核菌在pH值为6.0的固体培养基上生长最快有所差异；黑暗培养对苜蓿叶枯病菌菌丝生长有促进作用，与刘志恒[26]研究发现黑暗条件有利于白菜叶腐病病原菌(Rhizoctoniasolani)菌丝生长相同；在不同碳源、氮源培养基上生长情况差异明显，其中可溶性淀粉和硝酸钾对菌丝生长有显著的促进作用，与白菜叶腐病病原菌[26]、石竹茎腐病病原菌[27]最适碳源相似，但与上述两种立枯丝核菌最适氮源有所差异，这可能是分离的菌属于不同的菌丝融合群，生物学特性有一定的差异。根据病菌不喜酸性的特点，可采用石膏或酸性肥料等方法调节土壤酸碱度，抑制土壤中病菌的生长。

4 结论

本试验较为系统的分析了陕西省苜蓿叶枯病致病菌及其生物学特性，与以往报道立枯丝核菌引起苜蓿根腐病[7-9]不同，本试验明确了立枯丝核菌亦是苜蓿叶枯病致病菌，同时也是陕西省首次报道立枯丝核菌引起苜蓿叶枯病。苜蓿叶枯病原菌生物学特性研究发现该菌最适pH值为7.0；黑暗条件下有利于该菌生长；对碳源的利用效果中以可溶性淀粉最好，而对果糖利用效果最差；最适氮源为硝酸钾，而对硝酸铵利用效果最差。