疏肝消脂方防治高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠的实验研究*

邢宇锋 翟芬芬 韩志毅 彭得倜 钟伟超 周大桥 童光东

1.深圳市中医院肝病科 (广东 深圳， 518033) 2.深圳市福田区慢性病防治院

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是无过量饮酒史，而出现肝细胞脂肪变性、弥散性肝小叶轻度炎症和/或有肝窦周围、肝中央静脉胶原沉积等病理特征的慢性肝脏炎性疾病[1, 2]。NASH作为单纯性脂肪肝发展成为肝纤维化的一段病理阶段，是非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 常见的病理类型[3]。NASH的持久存在已成为肝硬化及肝癌的重要因素之一[4]。

目前该病在治疗上仍以运动、控制体重为主，他汀类降脂药能够改善血脂和胆固醇水平，但该类药物具有一定的副作用，其临床应用有一定受限。我们前期临床研究发现疏肝消脂方可以显著改善NASH患者肝脏炎症，降低血脂及体重[5, 6]。本研究采用疏肝消脂方干预高脂饮食诱导的NASH大鼠，以进一步明确疏肝消脂方防治NASH的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠90只(2月龄)，雌雄各半，体重180g～220g，购于广州中医药大学实验动物中心[合格证：SYXK(粤)2013-0001]，饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房。

1.2 药物与试剂 疏肝消脂方组成: 柴胡、枳实、桅子各10g，炒白芍15 g，茵陈、泽泻、山楂、海浮石各30g等。本研究采用免煎颗粒剂，购自深圳华润三九有限公司。非诺贝特胶囊(力平之，法国利博福尼公司，批号：H20140369) 。甘油三酯(TG)测定试剂盒、总胆固醇(TC)测定试剂盒均购于上海科华生物工程股份有限公司；Trizol购于TAKARA公司；逆转录试剂盒及RT-PCR试剂均购于德国DBI公司。

1.3 实验仪器 分光光度计，(UV-1206，日本SHIMODZU公司)；冷冻离心机(SCR20B，日本HITACHI公司)；电子天平(BS210S，日本Satorius公司)；(PCR扩增仪美国ABI公司)；实时定量PCR仪(StrataGene Mx3000P ，美国Agilent公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 按体重分层随机法，分为6组：正常组、高脂模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组、非诺贝特对照组。

1.4.2 动物造模及给药 采用经典的高脂饲料诱导大鼠肝脏组织脂肪变性的方法，复制 NASH 大鼠模型[7]。正常组大鼠给予普通饲料，其他 5 组大鼠则投喂高脂饲料(普通饲料加1%胆固醇、10% 蛋黄粉和10% 猪油)，连续喂养 12 周。造模第8周，每组随机抽选5只，做肝组织病理检测以判断造模是否成功。予各组大鼠给予相应药物灌胃：非诺贝特组( 0.1 g/kg/d)、疏肝消脂方低、中、高剂量组(70 kg 成人等效剂量 1、2、4 倍，10 g/kg/d、20 g·kg/d、40 g·kg/d)。正常组、高脂模型组则给予等体积蒸馏水灌胃。采集标本前 1 d 各组禁食不禁水，次日上午以10% 水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清置于-80℃冰箱保存待用；在肝右叶距边缘1cm处取肝组织两份，一份以4%多聚甲醛固定，一份于-80℃冰箱保存待用。

1.5 观察指标

1.5.1 各组大鼠肝脏组织湿重 分析天平称量各组大鼠肝脏组织湿重,结合末次大鼠体重,计算肝指数：肝指数=肝湿重/体重×100%。

1.5.2 各组大鼠肝脏病理形态学检测 将4% 多聚甲醛固定的肝组织取出，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，常规制备石蜡切片，烘干。苏木素-伊红(HE)染色后，光镜下观察大鼠肝组织的形态学变化。

1.5.3 各组大鼠肝脏脂质检测 取适量新鲜大鼠肝组织, 制组织匀浆, 并用甲醇-氯仿(按照1∶1)抽提液抽提脂质，以分光光度法测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG) 的含量。

1.5.4 各组大鼠肝组织PPARα和SREBP-1c基因表达检测 采用 RT-PCR法检测各组大鼠肝组织中PPARα和SREBP-1c基因表达情况。方法如下：每组随机抽取5只大鼠，在肝右叶距边缘1cm处取肝组织作为样本，抽取RNA，逆转录合成cDNA。cDNA作为模板，按照试剂盒说明分别加入引物和 Bestar·SybrGreen qPCR master Mix等，PCR反应条件：94℃ 2min，94℃ 20s，58℃ 20 s，72℃ 20s，40循环。融解曲线分析：温度62℃～95℃。每个样品重复3次荧光定量PCR实验。

表1 引物序列荧光定量PCR实验

1.6 统计学方法 采用 SPSS 19. 0 统计软件进行数据统计分析。实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组之间比较采用t检验，多组均数的比较采用单因素方差分析，P<0.01或P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理HE 染色结果 空白组大鼠肝组织着色均匀，肝细胞结构清晰，未见脂肪病变性；高脂模型组大鼠肝小叶内可见脂肪空泡、肝细胞出现气球样变，肝细胞内见大量脂肪空泡，小叶内可见炎性细胞浸润。疏肝消脂方低剂量组大鼠可见轻度的肝细胞脂肪变性，肝细胞内有散在空泡现象，比模型组有所改善。疏肝消脂方中、高剂量组和非诺贝特对照组，可见到肝组织脂肪变性、肝细胞肿胀的程度较模型组均明显改善，肝细胞的数量相对增多，趋于正常细胞。

2.2 各组大鼠肝脂质水平和肝指数情况 见表2。与正常组比较，高脂模型组大鼠肝脏中TG、TC均显著升高(P<0.01)。与高脂模型组比较，非诺贝特对照组、疏肝消脂方高、中剂量组大鼠肝脏中TG、TC水平能显著降低(P<0.05或P<0.01))，疏肝消脂方低剂量组大鼠肝脏中TC水平显著降低(P<0.05)；非诺贝特、疏肝消脂方各剂量组大鼠肝指数均显著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 各组大鼠肝脂质水平和肝指数比较 (x±s)

与正常组比较，▲▲P< 0.01; 与高脂模型组比较，*P<0.05，**P< 0.01

2.3 各组大鼠肝组织PPARα和SREBP-1c基因表达情况 见表3。与正常组比较，高脂模型组中大鼠肝组织的PPARα基因表达显著降低(P<0.05)，SREBP-1c基因显著升高(P<0.01)；与高脂模型组比较，疏肝消脂方各剂量组大鼠肝组织PPARα基因的表达，明显增强肝组织SREBP-1c基因的表达(P<0.05或P<0.01)。

表3 各组大鼠肝组织PPARα和SREBP-1c基因表达比较 (x±s)

与正常组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01; 与高脂模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

NASH是以肝细胞脂肪变性、灶性坏死及小叶内炎症为特征的遗传-环境-代谢应激相关性肝病。其发病机制尚未完全明确，当前Day等人根据动物实验结果提出的二次打击假说[8]，仍在NASH发病机制中占有重要地位。

高脂或高热量饮食、脂肪组织释放、肝细胞内脂肪酸合成增多等，产生过量的游离脂肪酸(FFA)，引发肝细胞内脂类的聚集[9]。肝细胞内的脂类不断聚集(第一次打击)可导致了一系列的肝细胞毒素事件( 第二次打击) ，产生肝脏的炎性反应[10]。肝脏的FFA增多时，引起TC、TG的合成超过其输出，导致TC、TG 在肝内蓄积。本实验结果也发现，高脂模型组大鼠肝组织TC、TG含量较正常组显著升高。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)和固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)与NASH的发生、发展密切相关，在NASH脂质代谢调节中发挥着重要作用[11]。肝脏的PPARα可影响脂蛋白和长链脂肪酸代谢，调控脂质代谢。PPARα的表达受抑时，与肝内脂肪酸代谢有关的蛋白质、酶基因的转录水平降低，减少脂肪酸的氧化和加重肝细胞内脂肪沉积及炎症反应[12]。SREBP-1c是负责调节脂肪酸和甘油三酯的重要调控因子，可激活下游多种参与脂肪酸和甘油三酯合成酶的转录，使脂肪酸合成增加，进而造成肝脏脂质的蓄积[13]，因此以从脂质代谢信号通路相关基因入手，开展对NASH脂质代谢紊乱机制研究具有重要意义。

前期研究已证明，疏肝消脂方对NAFLD患者的临床症状和实验室指标具有明显的改善作用。采用疏肝消脂方干预NASH大鼠，发现疏肝消脂方组大鼠血液中TG、TC、FFA、全血黏度(低切)、血浆黏度值、红细胞聚集指数和AST的水平明显下降(P<0.01)[7]。

本研究发现，疏肝消脂方各剂量组大鼠肝组织TG、TC及肝指数均较高脂模型组出现不同程度的降低，提示疏肝消脂方能有效地改善 NASH 大鼠肝脏脂肪沉积，有效的阻止了NASH的进展。这与本课题组前期临床的研究结果基本一致的[5]。同时，疏肝消脂方高中低剂量即可明显增强大鼠肝组织PPARα基因的表达，降低肝组织SREBP-1c基因的表达。这表明，疏肝消脂方可能通过上调PPARα、下调SREBP-1c基因的表达，进而调节肝内脂肪酸代谢，促进脂肪酸β氧化，这可能是其治疗NASH 的作用机制之一。疏肝消脂方防治NASH也可能是多途径、多层次、多靶点调控的结果，其详细机制还需要进一步的研究和分析。