皂荚提取物对肝癌大鼠微血管密度及肝脏病理影响的实验研究*

阮连国 张定宇 洪 可 张 妍 张赤志

1.武汉市医疗救治中心中西医结合肝病科 (湖北 武汉， 430023) 2.武汉市妇女儿童医疗保健中心 3.湖北省中医院肝病科

原发性肝癌(PLC)是常见恶性肿瘤，在全球癌症发病率中居第5位，死亡率居第3位[1]。其起病隐匿、进展快、易转移、生存期短、预后很差，在我国为恶性肿瘤第2位死因[2]。中医中药作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，具有独特疗效。前期临床研究证实皂荚治疗肝癌具有一定疗效[3],实验研究证实皂荚提取物通过抑制肝癌细胞端粒酶活性、调节肝脏组织Smad4 mRNA和Smad7 mRNA的表达 、加强TGF-β/Smads信号转导通路信号的传导、影响肝癌大鼠TIMP3/MMPs蛋白表达等抑制肝癌细胞增殖[4～9]。本实验研究皂荚提取物对肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝脏病理的影响，进一步探讨其抗肝癌作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞 Walker-256 癌细胞株购于上海拜力生物科技有限公司。雄性Wistar断奶大鼠6只，体重40～80g，供癌细胞增殖传代使用；SD雄性大鼠60只，体重200g±20g，作为实验动物，两组动物均购于湖北省实验动物研究中心。

1.2 药物 猪牙皂提取物正丁醇部位由湖北中医药大学药学院许汉林教授制作提供。

1.3 主要实验器材与试剂 -20℃及-80℃冰箱、超净工作台、微量加样器、恒温水浴槽、酶标仪、Eppendorf 管、玻璃吸管、低温高速离心机、15ml 离心管、手术器械一套(血管钳、三角针、有齿镊、组织剪、手术刀、5～0 丝线、持针器)、消毒棉球、棉签、注射器(1ml、5ml、10ml)。10%水合氯醛、PBS 缓冲液、0.9%氯化钠溶液、0.5%活力碘、红霉素软膏。

1.4 动物模型及分组 将Walker-256细胞株冻存管水浴融化，加入8ml PBS 缓冲液，以1000转/分的速度离心10min，去上清液，用PBS 缓冲液清洗及重悬细胞，在5 只Wistar大鼠的腹腔内分别注入1ml细胞悬液，1个月后观察大鼠腹部逐渐膨起，癌性腹水形成，从传代的 Wistar大鼠体内抽取癌性腹水5ml，离心、弃上清液，取下层粘稠浓缩腹水1ml备用。

60只大鼠随机挑选50只，分别使用水合氯醛麻醉、固定、消毒，行手术暴露大鼠肝脏，取最外层肝叶作为注射部位，将装有癌性腹水的注射器斜刺入肝叶内约 0.5cm，注入癌性腹水约0.05ml，快速拔出注射器针头，止血、逐层关闭腹腔，伤口消毒，进行一周的适应性喂养，随机分为5组，即皂荚提取物低剂量(0.15g/kg/d) 组(A)、皂荚提取物中剂量(0.3g/kg/d)组(B)、皂荚提取物高剂量(0.6g/kg/d)组(C)、索拉非尼(0.08g/kg/d)组(D)、模型(0.9%生理盐水10 ml/kg/d)组(E)，对肝癌大鼠进行灌胃。余下10只大鼠为空白对照组(F)：0.9%生理盐水10 ml/kg/d对正常大鼠进行灌胃。每天灌胃1次，每周连续灌胃6次，周日测大鼠体重，然后根据体重调整剂量，均连续给药30天，脊椎脱臼法处死大鼠，空白组大鼠取肝脏组织，造模大鼠选取肝脏内癌组织制作组织切片及留存。

1.5 MVD 的判断标准 参照Weidner校正方法，先用低倍镜(×10)在每一个标本下选取热点(5个微血管数最多的区域)，然后在每一个热点中计算一个高倍镜(×40)下的微血管数目，取其平均值为MVD值。

2 结果

2.1 各组大鼠肝癌组织MVD表达情况 见表1。

表1 各组大鼠肝癌组织中MVD表达比较±s)

与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01;与索拉菲尼组比较，△P>0.05

2.2 各组大鼠肝组织病理形态改变 见插页彩图1，空白组大鼠肝小叶结构完整清晰，胞浆胞核均匀，肝细胞索排列整齐，无纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶结构失常，肝小叶被肿瘤组织替代，肝血窦周围可见纤维组织增生；汇管区增宽，肿瘤细胞呈圆形，再生活跃，异型性明显，细胞核染色变深，核质比变大，部分出现核固缩和核碎裂现象，肿瘤细胞呈团块状分布。皂荚提取物低剂量组大鼠相对于模型组大鼠，肝小叶失去正常结构，一部分肝小叶被肿瘤组织取代；核固缩现象明显，核质比很大，部分细胞呈团块状；肝窦扩张，肝血窦周围有纤维组织增生。皂荚提取物中剂量组大鼠相对于模型组大鼠，肝小叶的结构有一定的恢复，肿瘤组织、异型性细胞数量和过塑细胞数量减少，肝血窦周围偶尔可见到纤维组织增生。皂荚提取物高剂量组大鼠肝小叶结构基本清晰完整，细胞胞浆胞核均匀，大部分肝小叶细胞正常，部分细胞有核固缩和异型性的现象，相较于模型组大鼠，状态改善很明显；肝血窦周围很少见到纤维组织增生。索拉菲尼组大鼠肝小叶结构基本清晰完整，细胞胞浆胞核均匀，肝细胞索排列整齐，胞核较大，整体分布较均一；肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润, 基本没有纤维组织增生。与正常组相比，有很少部分细胞的形态出现异型性，无团状分布现象。

3 讨论

肿瘤细胞的增殖、浸润、转移等生物学行为依赖于新生血管的生成，肿瘤微血管密度(MVD)作为衡量肿瘤血管生成的一个重要指标，与肿瘤的浸润转移及预后有着十分密切的关系[10]。肝癌是典型的多血管肿瘤，在其生长与转移中离不开肿瘤血管提供的营养物质及氧气，肝癌组织中微血管密度直接反映了血管生成情况[11]。因此，抗肿瘤血管生成已成为有效的抗肿瘤方法之一。

中医认为癌多为痰阻、气滞、血淤、热毒等相互博结而成，其中痰浊内阻是肿块最终形成的病机关键[12]。《丹溪心法》曰：“凡人身上、中、下有块者，多是痰”；“痰挟瘀血，遂成窠囊”。同时痰瘀可以互化，痰可致瘀，瘀可生痰[13]。中医古籍中，并无肝癌之病名，但有类似肝癌症状、体征和成因的记载，如“岩”“积聚”“癥瘕”“胁痛”“鼓胀”“黄疸”“腹痛”等，病机有“正虚”“邪实”两方面，《医宗必读·积聚》中说：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”肝癌病机可归纳为三点：其一是肝气失于条达，气滞血瘀；其二为痰饮内停，郁而化热，湿热蕴结；其三为肝肾亏虚，脾胃内伤，正气亏虚。故痰瘀毒交结，正不胜邪，而发癌肿，久留难去，而成危重之疾。关于肝癌治疗，《内经》中也载有“坚者削之”“结者散之”的治疗法则。秦汉时期《神农本草经》中记载的皂荚、海藻、鳖甲、半枝莲、黄芪等治疗肝癌，迄今仍具有较强的指导意义。皂荚味咸，性温，有小毒，具有祛顽痰，除湿毒的作用。唐代《千金要方》卷十九用皂荚治“积聚徴坚”等，是治疗癌症的常用中药。香港理工大学与美国国立癌症研究所研究发现，皂荚浓缩液具有抗癌的特性，可以有效抑制血癌及多种人类实体肿瘤，包括乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌细胞生长[14]。

本研究通过皂荚提取物对肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝脏病理的影响的观察，发现肝癌大鼠组织MVD明显增高，皂荚提取物可明显降低大鼠MVD，改善肝脏病理，提示皂荚提取物可以有效防治肝癌，其作用机理与调节肝癌组织MVD密切相关，其分子机制需进一步研究。