FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响机制分析*

王朝辉 辛永宁

1.青岛大学 (山东 青岛， 266071) 2.青岛市第六人民医院肝病科 3.青岛市市立医院消化科

肝细胞癌(HCC)是国内比较常见的一种恶性肿瘤，其不仅具有较高的发病率，还有很高的死亡率，对人们的生命健康造成了很大的威胁。国内乃至全球，每年都有大量的患者死于肝癌，因此肝癌的发病机制和临床治疗方案一直是医学界的研究热点[1，2]。 原发性肝癌具有病程进展迅速、复发率高且转移侵袭性强等特点，而且HCC的发病机制极为复杂，医学界截止目前仍未能完全精准的对其转移和复发等机制作出定论，这些都导致HCC在临床治疗中的效果不太理想，给临床医生带来了极大的挑战[3]。成纤维细胞生长因子受体是一种主要分布在细胞膜蛋白上的受体型蛋白酪氨酸激酶，其中FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4是目前已知的四种类型。FGFR作为一种重要的抗肿瘤药物靶标，尤其是FGFR4，已经被大量研究证实在乳腺癌、胃癌、胰腺癌的诊治中能够发挥重要的作用，但是在肝癌中应用的研究较少[4]。本次研究通过对FGFR4基因沉默对HCC细胞生物学行为影响机制进行深入研究，来为HCC的诊疗提供更多的参考，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料 本次实验所使用的人肝癌细胞株smmc-7721采购于上海慧颖生物科技有限公司，在本院实验室进行传代培养的操作。

1.2 研究方法 本次研究一共设计三条慢病毒载体(siRNA)并选择出最高效的一种来进行FGFR4的基因沉默，并通过对慢病毒载体质粒重组构建阴性对照质粒，之后进行慢病毒包装，根据滴度实验公式检测病毒滴度是否符合实验要求，并选择出最有效率的慢病毒滴度进行转染操作。本研究设立三组，其中A组为未进行转染操作的正常细胞组，B组为FGFR4基因序列被打乱后重组的阴性对照组，C组为经慢病毒转染后的FGFR4基因沉默组。

1.3 观察指标 将A、B和C三组细胞处理后铺至96孔板上，在铺到板上的第一天至第四天，向板上的每个孔中都加入CCK-8试剂，然后使用酶标仪检测三组细胞的吸光度来判断三组细胞的增殖能力。构建Transwell小室，然后将三组细胞悬液放置在其上层培养24小时，倒置显微镜观察统计每组细胞穿出上层小室的数量，使用200×光镜，每组观察十个视野的细胞数量，对比三组的平均统计结果，判断三组细胞的侵袭能力。采用流式细胞仪，并根据Annexin V-APC/PI双染法来观察和对比三组细胞的凋亡情况。采用Western Blot法检测三组细胞中相关蛋白的表达情况：pSTAT3、pERK和ERK信号通路相关分子的表达情况；增殖标志物PCNA、上皮标志物E-Cadeherin和间叶细胞标志物Vimentin的表达情况；Bcl-xL、Caspase-3和FLIP等相关凋亡分子的表达情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件作统计学分析，计量资料数以均数±标准差表示，计量资料间均数的差异比较用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组细胞增殖情况 对比发现，FGFR4基因沉默后(C组)，在第二天到第四天的时间，细胞增殖明显低于A组和B组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组和B组对比，各个时间均无明显差异，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图1。

图1 3组细胞增殖情况比较图

2.2 3组细胞侵袭能力比较 对比发现，A组和B组的细胞穿出计数(59.8±3.17，61.5±4.26)均显著高于C组(36.8±5.13)，差异有统计学意义(P<0.05)；A组和B组两组间对比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 3组细胞凋亡情况 对比发现，FGFR4基因沉默(siRNA)后的C组细胞凋亡分布的区域显著高于A组和B组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图2。

图2 3组细胞凋亡分布图

2.4 3组细胞FGFR4蛋白和相关效应蛋白表达情况 分析结果发现，FGFR4的蛋白表达对比，A组和B组显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；其他效应蛋白的对比中发现，C组FLIP、PCNA、Bcl-xL、pERK、pSTAT3和Vimentin的表达均显著低于A组和B组，而Caspase-3和E-cadeherin的表达则显著高于另外两组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

3 讨论

HCC作为一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤疾病，其治疗方法一直是近年来的研究热点，手术切除和放化疗是目前的主要治疗方法，但其疗效并不理想，尤其是对于患者生存率的提高并不显著[5，6]。随着现代医学的发展，分子靶向治疗药物被越来越多的用于临床治疗肿瘤疾病的研究，如VEGF和EGFR等，其在乳腺癌、肺癌等肿瘤疾病的临床治疗中已经取得了非常明显的进展，但是这些并没有给肝癌的临床治疗带来帮助[7，8]。找到一种有效的治疗靶点，对于HCC的治疗意义重大。近年来人们越来越多的开始关注FGFR家族，尤其是FGFR4，作为一种重要的抗肿瘤药物靶标被国内外的研究者和药物专家所广泛关注[9]。

国外的一些研究将FGFR4沉默应用到乳腺癌以及结肠癌细胞系中发现，癌细胞都因FGFR4的沉默，而出现了显著的侵袭能力减弱，增殖能力受到抑制，而且细胞存活率也明显下降[10]。本次研究通过对比不同处理因素下三组间的细胞吸光度差异后发现，C组吸光度显著低于另外两组，而另外两组间对比无明显差异，细胞吸光度的高低可以反映细胞的生存率，即细胞的增殖能力，而本次研究结果证实，肝癌细胞受到FGFR4被沉默的影响，增值能力明显得到了抑制。对细胞穿越计数统计发现，受到FGFR4被沉默的影响，C组肝癌细胞穿越数量显著降低，这说明C组癌细胞的侵袭能力显著降低。对三组细胞凋亡情况的分析，发现C组细胞凋亡数量明显高于另外两组，细胞凋亡率明显升高。这些研究结果均与国内外将FGFR4沉默应用于其他恶性肿瘤疾病的研究结果一致[11]。我们通过进一步对三组间相关效应蛋白表达情况的对比发现，Bcl-xL和FLIP作为重要的凋亡通路和相关凋亡分子，增殖标志物PCNA都在C组出现了明显的降低，而Caspase-3的表达显著升高，这进一步证实HCC细胞的增殖能力被明显抑制。pERK和pSTAT3两种蛋白表达受到FGFR4沉默的影响明显降低，这表明FGFR4沉默后，对这两种信号通路产生了显著的影响，进而对HCC细胞的生物学特性产生了重要影响。而C组间充质标记Vimentin蛋白表达的明显降低和上皮标记E-Cadeher表达的增高，说明FGFR4沉默后对上皮-间叶转化的通路表达产生了抑制作用，这与国外关于结肠癌的此类研究结果相一致[12]。

综上所述，FGFR4沉默后，肝癌细胞的增殖能力受到了显著的抑制，癌细胞侵袭性明显下降，肝癌细胞的凋亡率显著上升。这一特性在肝癌的临床治疗中，能够发挥巨大的作用，值得进行深入研究。