子宫内膜微刺激对IVF-ET中LIF、OPN表达及子宫内膜容受性的影响

巫珊 李丹 刘晶晶 李俊魁 马艳华

随着医学的进步与发展，辅助生殖技术解决了不孕夫妇的生育困难问题，而成功率始终是关注的重点，即使有近90%的胚胎可以成功移植，但临床妊娠率却仍只有30%～40%[1]。有研究表明IVF-ET的平均着床率约为25%[2]，胚胎本身原因仅占1/3，而子宫内膜接受能力导致植入失败约占2/3[3]，可见胚胎移植成功除需要优质胚胎外，子宫内膜的容受性也是成功与否的关键因素之一。因此子宫内膜容受性的相关研究，对于提高妊娠率具有重大意义。本研究通过子宫内膜微刺激观察胞饮突变化及容受性相关细胞因子表达，研究子宫内膜微刺激对子宫内膜容受性的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月～2017年12月在我院接受IVF-ET的不孕患者120例。按患者预约降调日日期的奇偶数分组，预约降调日日期为奇数的患者纳入微刺激组（共68例），预约降调日日期为偶数的患者纳入非微刺激组（共52例），其中微刺激组中2例，非微刺激组1例卵子由于未完成受精从而取消周期；微刺激组3例，非微刺激组1例由于无可移植的胚胎而取消周期；微刺激组5例，非微刺激组3例由于获得的卵母细胞数较多，为了避免OHSS而取消移植。纳入本研究数据统计的微刺激组有58例，非微刺激组有47例。在胚胎移植前一月经周期的第3～5天对微刺激组进行子宫内膜微刺激（浅表机械性搔刮），非微刺激组则未行刺激。纳入标准：①所有患者年龄24～35岁；②月经规则，宫腔形态正常、无宫腔手术史（电切、黏连分解等），基础状态监测时无输卵管积水及卵巢囊肿；③助孕周期前3个月内未服用促排卵药、避孕药或放置宫内节育器；④不孕的原因主要为输卵管因素、男方因素（少弱精子症），经子宫输卵管造影或超声下子宫输卵管通液及精液常规检查证实。排除标准：①子宫畸形、子宫内膜异位症、子宫腺肌症、盆腔结核等；②合并高血压性疾病，内分泌疾病如糖尿病、甲亢、高泌乳素血症等。本研究经伦理委员会批准并签署知情同意书。

1.2 方法 月经来潮第3～5天微刺激组患者进行术前常规检查，术中在不扩宫的情况下探针探宫腔深度，最小号刮匙（内径宽度约2mm）轻柔搔刮宫腔内前、后、左、右壁各一下，将内膜组织标本送病理检测。当月黄体中期微刺激组及非微刺激组所有患者进行子宫内膜活检，电镜下观察胞饮突变化，免疫组织化学技术检测子宫内膜LIF和OPN的蛋白表达。

1.3 结局判定 胚胎移植后两周测定血/尿HCG，如β-HCG＞20IU或尿检阳性者为生化妊娠；胚胎移植后4～5周检测到妊娠囊者为临床妊娠。记录研究参数：妊娠囊个数。统计研究参数：着床率=孕囊个数/移植胚胎个数，妊娠率=妊娠例数/胚胎移植例数。本研究以临床妊娠作为妊娠的判断标准。

胞饮突的判定：含有胞饮突的子宫内膜/整个内膜＞50%为丰富，20%～50%为适中，＜20%为微量。

免疫组化结果的判定：实验需同时进行对照染色，以增加结果的准确性；抗原在特异性的位置表达即表达特异，否则为假阳性；阴性结果不可以有抗原表达；满足以上3点记为阳性表达。LIF、OPN阳性结局判定：棕褐色，细颗粒状，背景不着色，记为阳性表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS软件进行统计学分析，两组计量资料比较采用独立样本t检验，釆用χ2检验比较两组间率或构成比，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床特征 两组患者的年龄、体质指数（BMI）、不孕年限、不孕原因（男方因素、女方盆腔输卵管因素、双方因素）、不孕类型（原发、继发）、FSH基础值、LH基础值以及FSH/LH无统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.2 不孕患者COH治疗情况 两组患者Gn启动时窦卵泡数、使用Gn总量、使用Gn天数，以及HCG 日 E2、P比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 患者受精率、胚胎着床率、临床妊娠率情况 对两组患者获卵数目、移植优质胚胎数、受精率、胚胎着床率、临床妊娠率指标进行统计分析，微刺激组58对夫妇，共有81个周期，获得卵母细胞数为767枚；非微刺激组47对夫妇，共有56个周期，获得卵母细胞数为472枚。微刺激组受精率为72.0%，非微刺激组受精率为76.2%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；微刺激组胚胎着床率为38.1%、临床妊娠率为55.2%，非微刺激组分别为24.5%和38.3%，微刺激组胚胎着床率和临床妊娠率均高于非微刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.4 微刺激组与非微刺激组患者胞饮突变化 微刺激组患者的胞饮突表达较非微刺激组更为丰富，微刺激组胞饮突表达丰富为63.8%，而非微刺激组胞饮突表达丰富为36.2%，微刺激组与非微刺激组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。通过扫描电子显微镜观察到子宫内膜中检测到胞饮突阳性表达，位于子宫内膜的顶端上皮细胞突起，凹陷处较丰富，呈单个花蕾样膜突起，单纤毛细胞将胞饮突分隔。

表1 微刺激组与非微刺激组患者临床特征

表2 微刺激组与非微刺激组患者COH治疗情况（±s）

表2 微刺激组与非微刺激组患者COH治疗情况（±s）

项目 微刺激组 非微刺激组 t P例数 58 47 Gn启动时窦卵泡数（个） 13.72±2.97 13.73±3.51 0.0750.927 Gn总量（IU） 27.69±10.21 26.05±9.20 0.9850.325 Gn使用天数 11.65±1.58 11.33±1.52 1.1120.268 HCG日E2（pg/ml） 3258.79±1839.522912.85±1607.211.0890.264 HCG日P（mg/ml） 0.92±0.60 1.07±0.36 -1.3810.166

表3 两组患者受精率、胚胎着床率、临床妊娠率比较

表4 两组患者子宫内膜胞饮突变化比较（%）

2.5 微刺激组与非微刺激组患者LIF、OPN检测微刺激组与非微刺激组患者的LIF、OPN免疫组化染色结果显示，在蛋白水平LIF与OPN表达于子宫内膜表面细胞与腺上皮细胞中，微刺激后LIF、OPN在胞质中棕褐色染色颗粒遍布更多。微刺激组与非微刺激组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 两组患者子宫内膜免疫组化检测（×20）

3 讨论

近年来随着不孕患者越来越多，辅助生殖技术迅速发展，早期认为胚胎着床的成功只与配子质量、胚胎质量有关。随着辅助生殖技术的不断发展，发现在配子质量和胚胎质量提高的情况下，临床妊娠率均无明显变化，因此学者们将研究方向转至子宫内膜。研究者[4]发现着床失败的不孕患者子宫内膜容受性都存在缺陷，因此研究人员把子宫内膜容受性也列为胚胎着床成功的关键因素。胚胎着床过程有严格的时间限制和空间限制。

本研究在进行检测前对微刺激组和非微刺激组患者的年龄、BMI、不孕年限、不孕原因、不孕类型、辅助方式（IVF-ET）、FSH基础值、LH基础值、FSH/LH等进行统计分析，发现微刺激组与非微刺激组无统计学差异（P＞0.05），说明此研究方法设计合理，后续研究得到的数据结果具有代表性。检测微刺激组与非微刺激组Gn启动时窦卵泡数、Gn总量、Gn使用天数、HCG日E2和P，两组患者在控制性超促排卵治疗的情况下，无统计学差异（P＞0.05），说明后续结果不是COH治疗情况引起的不同。两组患者获卵数、移植优质胚胎数、受精率差异无统计学意义（P＞0.05），说明两组患者进行相同的操作，证明研究的可靠性。在进行胚胎移植前子宫内膜微刺激组患者胚胎着床率（38.1%）、临床妊娠率（55.2%）均高于非刺激组的24.5%和38.3%，微刺激组与非微刺激组之间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），由此说明子宫内膜微刺激可以提高胚胎着床率和临床妊娠率，为提高辅助生殖患者妊娠率提供了可能。

子宫内膜上皮有纤毛细胞和无纤毛细胞存在，开始时细胞表面由光滑而形成小的突起，之后渐渐增大，丢失微绒毛成为胞饮突[5，6]。胞饮突的作用为：可以预防纤毛的清除；促进胚胎与子宫上皮表面的接近；具有分泌功能，且LIF在胞饮突中高水平表达[7]，是诱发子宫内膜容受性必不可少的条件[8]。本研究结果显示微刺激组患者的胞饮突表达较非微刺激组更为丰富，微刺激组胞饮突表达丰富为63.8%，而非微刺激组胞饮突表达丰富为36.2%，两组胞饮突丰富程度比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。扫描电镜检测胞饮突在子宫内膜中阳性表达，位于子宫内膜的顶端上皮细胞突起，腺上皮开口处周围的凹陷处较丰富，呈单个花蕾样膜突起，单纤毛细胞将胞饮突分隔。由此说明，子宫内膜微刺激可以提高胞饮突的表达，可能微刺激子宫导致子宫内膜细胞释放一些细胞因子如LIF、OPN等，引起子宫内膜发生变化，胞饮突的变化可能是观察到的最为直观的现象，由此认为子宫内膜容受性也在发生变化。子宫内膜微刺激可以提高胞饮突的表达，可间接证实提高胚胎着床率和临床妊娠率。

白细胞抑制因子（LIF）是IL-6家族的多效分泌细胞因子，可作用于各种组织和细胞类型[9，10]。LIF在子宫内膜腺体中表达，并作用于子宫腔上皮细胞，LIF有助于植入的粘附和侵袭阶段，并且通过控制HLA-G抗原的表达参与滋养层细胞侵袭性的调节[11]。Bhatt等[12]研究发现LIF表达最丰富的部位是子宫内膜腺体，特别是在妊娠第4天，同时对小鼠中的LIF表达进行检测，发现非孕鼠子宫内膜中不表达LIF，胚胎种植期内膜中LIF出现强烈表达。LIF可以调节25个信号通路，其中一些信号通路已经证实是胚胎植入必不可少的[13]。骨桥蛋白（OPN）是细胞外基质中一种分泌性磷酸糖蛋白，是细胞外基质蛋白家族成员之一，参与多个生物过程，如细胞的粘附、增殖及分化等，几乎参与了胚胎着床的全过程[14]。Johnson等[15]研究发现细胞外基质蛋白OPN是组织营养因子，在胚胎的粘附和植入过程中位于子宫上皮和滋养层表面，OPN负责细胞骨架重组，作为滋养层与子宫上皮之间粘附的桥梁。本研究结果显示，微刺激组与非微刺激组患者LIF、OPN 免疫组化染色表达于子宫内膜表面细胞、腺上皮细胞，微刺激后LIF、OPN在胞质中棕褐色染色颗粒遍布更多。由于LIF、OPN在子宫内膜的移植期表达下降，使胚胎的识别、粘附和移植过程受损，影响了胚胎着床，是导致不孕患者妊娠率低和流产率高的重要原因之一。LIF、OPN都是子宫内膜容受性的标志性细胞因子，微刺激后发现两个因子都有明显提高，OPN的提高不明显，但与非微刺激组相比也有所提高，LIF的提高较明显，也可以证实LIF是子宫内膜容受性的标志性因子。微刺激提高子宫内膜容受性的标志性细胞因子LIF、OPN蛋白水平的表达，是子宫内膜容受性提高的直接证据。

综上所述，通过对子宫内膜进行微刺激，内膜自我损伤修复改善了内膜容受性，提高了胚胎着床率及临床妊娠率。但微刺激程度、患者微刺激时间等具体的最佳标准仍不确定，需要进一步探索。同时子宫内膜微刺激的作用机制目前无明确定论，无法为提高子宫内膜容受性提供理论支持，需要进一步的研究，以改善胚胎着床率和临床妊娠率。