心肌自噬在肾去神经联合氨氯地平治疗高血压大鼠心肌肥厚中的作用

黄炯华，宋代富，区德锦，谢文杰，戴文军

高血压是心力衰竭的重要病因之一，其可以激活交感神经分泌肾上腺素能体液因子，触发心肌肥厚的发生、发展。部分动物实验[1-3]和小样本临床试验[4-5]证实，经双侧肾动脉去交感神经治疗，可抑制肾交感神经活性降低血压减缓心脏肥厚的进展。前期动物实验[6-7]显示，双侧肾动脉去神经联合美托洛尔或氯沙坦治疗，能抑制自发性高血压诱导的心肌肥厚。同时，既往血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞肥大模型实验[8]表明，抑制心肌细胞自噬可减轻心肌细胞肥大。然而，心肌自噬在双侧肾去神经联合氨氯地平治疗高血压心肌肥厚中的作用仍不明确。该研究拟通过自发性高血压大鼠心肌肥厚动物模型，探讨心肌自噬在肾去神经联合氨氯地平治疗高血压心肌肥厚中的作用。

1 材料与方法

1.1材料SFP级8周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat， SHR)大鼠24只，体质量(142.17±11.35)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK(京)2016-0001；氨氯地平购自大连美仑生物技术有限公司(MB1725)；RNA逆转录及荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；Western blot相关试剂购自上海索莱宝生物科技有限公司；细胞裂解液NP-40及Western发光试剂购自上海碧云天公司；PVDF膜购自瑞士罗氏公司；辣根过氧化物二抗购自武汉博尔德公司；多功能泛素化结合的折叠蛋白(sequestosome1，SQSTM1/p62)和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体购自美国Epitomics公司。

1.2方法

1.2.1高血压心肌肥厚动物模型构建及分组 参照先前关于自发性高血压大鼠的实验[6]结果，12周龄的SHR可出现高血压心肌肥厚改变。本实验以12周龄的SHR作为高血压心肌肥厚的研究对象。依据是否进行双侧肾动脉去神经治疗，随机分为3组：假手术组(A组)、双侧肾动脉去神经+空白药物对照组(B组)、双侧肾动脉去神经+氨氯地平组(C组)，共3组，每组8只动物。

1.2.2动物给药途径和参照的剂量 根据文献[9]选定剂量，C组每天给予氨氯地平原药(MB1725)10 mg/kg灌胃，A、B组的大鼠分别每天给予等体积生理盐水和等剂量的空白对照药物灌胃，连续4周。

1.2.3左室体重指数(left ventricular mass index,LVMI)的测定 干预治疗4周，大鼠用乌拉坦麻醉处死后，快速获取心脏，称全心重(heart weight, HW)，并快速分离左心室并称量(left ventricular weight, LVW)，以LVW与HW之比计算LVMI。

1.2.4心肌HE染色 干预治疗4周，获取大鼠的心脏，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，心脏横向切片，HE染色。组织切片显微镜观察并拍图。

1.2.5肥厚基因的表达的检测 取100 mg左心室组织剪碎，用TRIzol试剂匀浆，抽提组织总RNA。用RT-PCR试剂盒检测β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)和心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的表达量。RT-PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6自噬标志蛋白定量测定 心肌组织收集后采用NP-40裂解液进行抽提，蛋白浓度通过BCA法测定。约取样品40 μg蛋白进行电泳分离和转膜。将承载有目的蛋白膜用5%脱脂奶粉进行封闭1 h，然后加入单克隆抗体p62、LC3和GAPDH于4 ℃孵育过夜。孵育过夜的蛋白膜用PBS-T液洗涤后，加入免疫二抗进行孵育免疫共沉淀反应。免疫复合物通过曝光液进行曝光获取底片。蛋白相对表达量用内对照蛋白GAPDH标准化后计算获取。

2 结果

2.1各组大鼠心脏形态及局部病理结构变化获取心脏标本，观察形态变化；并行横切面HE染色，观察大鼠心肌组织局部的病理变化。结果表明，心脏形态比较可见B组、C组较A组小，以C组更明显。HE染色：A组室壁较厚，心腔变小，向心性肥厚，B组、C组心室壁厚度明显减小，见图1。

图1 各组大鼠心脏形态及横切面HE病理切片的改变 SP ×20

2.2各组大鼠LVMI的变化通过计算各组大鼠LVMI并进行比较。结果显示，A组、B组和C组LVMI分别为(4.43±0.83)×10-3、(3.21±0.61)×10-3及(2.22±0.65)×10-3，组间比较差异有统计学意义(F=85.39，P<0.01)。其中与A组比较，B、C组的LVMI减低；与B组比较，C组降低更明显，差异均有统计学意义。见图2。

图2 各组大鼠LVMI的变化与A组比较：△P<0.05；与B组比较：*P<0.05

2.3各组大鼠心肌肥厚基因表达的变化RT-PCR测定结果显示，A组、B组和C组ANP的相对表达量分别为(1.03±0.13)、(0.6±0.06)及(0.41±0.07)，组间比较差异有统计学意义(F=89.39，P<0.01)；β-MHC的相对表达量分别为(0.99±0.12)、(0.59±0.06)及(0.32±0.05)，组间比较差异有统计学意义(F=134.22，P<0.01)。其中与A组比较，B组和C组的ANP和β-MHC下调；与B组比较，C组下调更明显，差异均有统计学意义。见图3。

图3 心肌组织肥厚基因(ANP和β-MHC)表达的变化与A组比较：△P<0.05；与B组比较：*P<0.05

2.4心肌自噬活性标志蛋白的表达变化Western blot检测结果显示，A组LC3-Ⅱ的表达增加，B组和C组表达减少，组间比较差异有统计学意义(F=3.20，P<0.05)；而B组和C组的p62表达增加，以C组明显，组间比较差异有统计学意义(F=28.12，P<0.05)。见图4。

图4 心肌组织自噬活性标志蛋白(LC3和p62)表达的变化

3 讨论

本研究结果显示心肌自噬活性改变在双肾动脉去神经治疗高血压心肌肥厚起到重要作用，其中以联用氨氯地平治疗时其效果更明显。既往实验[6]表明，12周龄SHR呈现心肌肥厚改变。为此，本研究以12周龄SHR为心肌肥厚的研究对象，探讨心肌自噬在肾去神经及联合氨氯地平治疗高血压大鼠心肌肥厚中的作用。

压力负荷是致心肌肥厚的重要诱因，心肌肥厚的病理表现为心室壁变厚、心肌重量增加、心肌细胞肥大、心肌纤维化、肥厚基因表达增加。心肌肥厚的持续加剧，会导致患者不良预后，如心源性猝死和心力衰竭[10]。为此，左室肥厚作为心力衰竭的独立预测因素[11]。目前，本研究12周龄SHR的心肌增厚，肥厚基因表达增加，心肌病理切片显示肥厚改变，这与既往压力负荷诱导心肌肥厚的结果一致。同时，本研究结果显示通过对高血压心肌肥厚的大鼠施行双侧肾动脉去神经治疗或联合苯磺酸氨氯地平治疗均能改善心肌肥厚的相关指标，其中以后者更显著。

生理水平的自噬反应是机体维持内环境稳定所必需的过程。然而，自噬过度或不足均会导致疾病的发生和发展。既往研究[12]表明，压力负荷诱导的心肌肥厚，存在自噬的过度激活；自噬的过度激活是压力负荷心肌肥厚的主要参与者[13]。先前的研究[14]证实，LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)和p62是联合评价体内自噬活性的标志蛋白，当体内自噬活性增加时，LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上调，而p62表达下调；当体内自噬活性受抑制时，其表达侧相反。目前本研究SHR诱导的大鼠心肌肥厚的实验中，LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上调，而p62表达下调；经肾去神经治疗后，其两者的表达相反，其中以联合氨氯地平治疗组更明显。这些结果表明，心肌自噬活性的改变在双侧肾动脉去神经或联合氨氯地平抑制心肌肥厚中起到重要作用。

综上所述，笔者猜测肾去神经联合氨氯地平抑制高血压性心肌肥厚，其作用可能与心肌自噬活性改变相关。