β-隐黄素对实验性牙周炎大鼠氧化应激的影响

崔晓宇，王国芳，李小红，张 朋 ，李冬雪，轩亚茹

牙周炎是由菌斑微生物与宿主组织相互作用引起的牙周支持组织的炎性感染性疾病，主要表现为软组织破坏和牙槽骨丧失，是成年人牙齿松动和脱落的首要原因[1]。近年来，各种证据表明氧化应激在牙周炎的发生发展机制中起重要作用。在炎症状态下，活性氧自由基的过度产生导致机体氧化应激和抗氧化防御系统失衡，从而对组织细胞产生损伤[2]。减少氧化损伤和增加抗氧化能力是治疗牙周病的关键。β-隐黄素，是一种已被证实的具有多种生物活性的类胡萝卜素，广泛存在于柑橘、玉米、豌豆等多种果蔬中，其生物安全性已被认证[3]。Liu et al[4]研究显示β-隐黄素可以抑制镉诱导的大鼠睾丸组织的氧化应激反应。因此，推测β-隐黄素可能在牙周组织的氧化应激中具有一定的保护作用。然而，有关此方面的研究尚未见报道。该研究旨在初步探讨β-隐黄素如何影响内毒素(lipopolysaccharide, LPS)/结扎诱导的牙周炎大鼠氧化应激反应以及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂及器械β-隐黄素(美国Sigma公司)；LPS(索莱宝生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒(南京建成生物技术公司)；显微照相系统(日本Olympus公司)； Leica SM 2000R切片机(德国徕卡Microsystems Nussloch公司)；TDL-5离心机(上海安宁科学仪器厂)；DW-86L626立式超低温保存箱(青岛海尔公司)；显微外科器械。

1.2实验对象选取8周龄雄性 SD大鼠30只，280～330 g，由山东省济南市实验动物中心提供，合格证号：SCXK(鲁)2014-0007。动物分笼饲养，自由摄食、饮水，适应性喂养一周。

1.3牙周炎动物模型的建立方法随机取10只大鼠为正常对照组，剩余动物以7%的水合氯醛按3 ml/kg体重腹腔注射麻醉。采用口腔正畸结扎丝(直径0.2 mm)环绕双侧上颌第二磨牙牙颈部一圈，结扎丝尽量靠近龈缘，于腭侧打结压向牙齿舌面，尽量避免损伤牙龈上皮。定期观察结扎丝是否移位或脱落。同时在相应牙颊腭侧龈沟内注射LPS(30 μl/只)[5]，每48 h注射1次。当牙龈出现红肿、糜烂、轻探易出血、牙齿松动等症状时则造模成功。将20只建模成功的牙周炎大鼠再随机分为牙周炎组和β-隐黄素治疗组。β-隐黄素治疗组在注射LPS后于相同位点注射β-隐黄素(12 μg/只)[6]，每48 h一次。作为对照，牙周炎组注射等剂量的生理盐水。

1.4样本采集于给药后第7天，以10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射深度麻醉后行腹主动脉采血，室温下静置30 min～1 h, 3 000 r/min离心15 min取上清液，分装至已登记编号的离心管中，-80 ℃保存备用。采用脱颈法处死大鼠，取双侧上颌骨。左侧上颌骨(含牙龈、牙齿、牙槽骨)稍作修剪去除多余组织后，置于10%中性福尔马林固定液中，登记编号，4 ℃保存备用。右侧上颌骨取第二磨牙周围牙龈组织，立即以4 ℃冰生理盐水漂洗去除表面血液，滤纸吸干，分装编号，-80 ℃保存备用。

1.5组织病理学分析左侧上颌骨固定48 h以上后，取出结扎丝，并在10% EDTA脱钙液中脱钙，脱水，二甲苯清洗，石蜡包埋。沿磨牙近远中方向切成4 μm的切片，每个样本收集3张切片，用HE溶液染色，显微镜下挑片，进行组织学分析。

1.6牙龈组织和血清中相关指标检测牙龈组织：组织块称重，冰浴速剪置于组织匀浆器中，加入预冷的匀浆介质(pH 7.4，0.01 mol/L 蔗糖，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA2Na 溶液)按组织块重量：匀浆介质体积为1 ∶9制备10%的组织匀浆, 4 ℃、3 000 r/min离心15 min, 取上清液。血清：复温至室温。采用试剂盒检测牙龈组织和血清中的 MDA、SOD及GSH-Px的活性： MDA检测采用硫代巴比妥酸法(TBA法)；SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法；GSH-Px活力检测采用双硫代对硝基苯甲酸比色法(DTNB法)，以上操作均严格遵守试剂盒说明书。

2 结果

2.1组织学分析-HE染色结果选择大鼠上颌第一和第二磨牙之间的区域为代表，图像放大40倍：正常对照组大鼠牙周组织包括充满邻间隙的牙龈乳头，牙槽骨嵴顶外形边缘整齐，结合上皮附着于釉牙骨质界处(cemento-enamel junction, CEJ)，见图1A1；相反，牙周炎组结合上皮位于CEJ的根方，于牙面剥离，有深牙周袋形成，见图1B1；β-隐黄素治疗组结合上皮位于CEJ稍下方处，牙周袋变浅，见图1C1。图像放大200倍：正常对照组结缔组织内有极少量炎症细胞浸润，牙周膜纤维排列有序，见图1A2；牙周炎组结缔组织内有大量炎症细胞浸润，胶原纤维排列紊乱甚至断裂，牙周膜间隙增宽，牙槽骨出现不规则吸收，嵴顶边缘不整，见图1B2中a、b标记处；β-隐黄素治疗组结缔组织内见少量炎症细胞浸润，牙周膜纤维排列整齐，牙周膜间隙稍增宽，牙槽嵴顶边缘较整齐，有少量骨吸收，见图1C2中c、e标记处。

图1 大鼠磨牙间牙周组织学观察 HE染色

A:正常对照组；B:牙周炎组；C: β-隐黄素治疗组；1：×40；2×200；G:结缔组织；PL:牙周韧带；D:牙本质；AB:牙槽骨；黑色箭头所示为釉牙骨质界(CEJ)

2.2氧化标志物水平检测牙龈组织中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的变化：与正常对照组比较，牙周炎组MDA的生成水平显著增高且SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与牙周炎组比较，β-隐黄素治疗组MDA的生成水平显著降低且SOD和GSH-Px活性明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 β-隐黄素给药对大鼠牙龈组织中MDA、SOD、GSH-Px的影响

与正常对照组比较：#P<0.05; 与牙周炎组比较：*P<0.05

表2 β-隐黄素给药对大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px的影响

与正常对照组比较：#P<0.05; 与牙周炎组比较：*P<0.05

血清中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的变化：与正常对照组比较，牙周炎组MDA的生成水平显著增高且SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与牙周炎组比较，β-隐黄素治疗组MDA的生成水平显著降低且SOD和GSH-Px活性明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

牙周炎的发生是多种危险因素作用的结果，其中牙周致病菌刺激宿主免疫/炎症反应，使得中性粒细胞(PMN)和吞噬细胞被趋化和激活，侵入牙周组织并诱导蛋白水解酶的释放和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生。ROS的大量产生引发了一系列降解和破坏细胞膜的连锁反应并生成过氧化脂质，最终分解成次级产物如MDA。另一方面，机体产生各种抗氧化酶以抵消过量的ROS并修复损伤，包括SOD、过氧化氢酶(CAT)和GSH-Px。当机体的抗氧化防御系统不能及时清除有害的ROS时，ROS将在组织内蓄积，导致氧化应激形成，造成或加重牙周组织损伤[7]。因此，寻求具有抗氧化作用且副作用少，成本较低的化合物是防治牙周炎的一种重要途径。

近年来，Sanbe et al[8]研究表明非酶促抗氧化剂的摄入可降低牙周病变组织中炎症细胞的浸润数目和脂质过氧化的水平，提高牙周炎的愈合能力。β-隐黄素作为一种具有抗氧化性能的天然化合物[4]，可能对缓解牙周炎的发病进程起有效作用。本实验使用LPS/结扎联合诱导牙周炎动物模型，建模大鼠5 d后出现牙龈缘红肿糜烂，轻度萎缩，轻探出血。颌骨组织病理学结果显示，与正常对照组比较，牙周炎组结合上皮根方迁移，炎症细胞浸润和牙槽骨破坏明显，说明本实验成功建立了实验性牙周炎大鼠模型。而β-隐黄素治疗组与牙周炎组相比，结缔组织内炎性细胞浸润数目以及结合上皮根方迁移的距离和牙槽骨吸收量均明显减少，说明了β-隐黄素对减轻牙周支持组织的炎症和破坏起一定的积极作用。

牙龈组织中各种成分变化是牙周病最直观的表现[9]。此外，外周血中氧化标志物的变化可以反映牙周组织的局部炎症与全身氧化应激状态的关系[10]。本实验从大鼠牙龈组织和外周血中检测和比较MDA含量以及SOD、GSH-Px的活性。结果显示，与正常对照组比较，牙周炎组大鼠的牙龈组织和血清中的MDA含量明显增高，而SOD和GSH-Px的活性明显降低，表明大鼠牙周组织的氧化应激反应显著，同时也与全身氧化应激状态密切相关，与研究[11-12]报道的结果相一致。这是由于炎症细胞产生过量的氧自由基，而消除氧自由基的固有氧化剂含量不足引起的。给予β-隐黄素后显示，与牙周炎组比较，用药组牙龈组织和血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量降低，表明了外源性补充β-隐黄素可以减轻氧化应激反应，提高机体的抗氧化能力，对牙周组织起到保护作用。

此外，Matsumoto et al[6]研究发现，β-隐黄素可以抑制LPS诱导的破骨细胞形成以及大鼠牙槽骨吸收。Nishigaki et al[3]体外实验发现β-隐黄素可以抑制人牙周膜细胞对机械应力和牙周致病菌共同诱导的IL-6和IL-8的表达并上调OPG的产生。课题组前期研究[13]显示，给予β-隐黄素治疗的牙周炎大鼠牙周组织内成熟的破骨细胞数目明显少于牙周炎组，RANKL/OPG的比值下调。这一系列的细胞及动物实验研究证实β-隐黄素可以通过抑制炎症细胞因子的表达和破骨细胞的形成来减轻牙周病变组织的炎症和骨丧失。

综上所述，β-隐黄素具有良好的抗炎和抗氧化作用，在牙周炎的防治中有潜在的应用价值。但目前关于β-隐黄素在牙周炎中具体作用机制的研究尚不全面，以及β-隐黄素的用药剂量、给药途径和时间也不明确，需要大量的实验来进一步探索。