MTT法检测夏枯消瘤丸含药血清对人肺癌A549细胞的实验研究

王素娟，王 恺，侯燕琳

（山西省中西医结合医院，山西太原030013）

本研究以探寻中医药治疗肺癌的高效低毒途径为出发点，探讨夏枯消瘤丸含药血清对人非小细胞肺癌A549的干预，采用MTT法检测人肺癌A549细胞的增殖，探讨夏枯消瘤丸含药血清对人肺癌A549细胞的细胞毒作用，从而明确夏枯消瘤丸对肿瘤的抑制作用。观察不同组别及含药血清浓度组对人肺癌A549细胞的细胞形态及生长状态的影响，从而探究其抑制肿瘤生长的有效浓度及剂量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，35只，体质量250～300 g，雌雄各半，购自山西医科大学实验动物中心［许可证号：scxk（晋）2009-0001］。饲养温度23℃左右，相对湿度（60±10）%。

1.1.2 实验药物 夏枯消瘤丸：江阴天江药业有限公司生产颗粒剂。顺铂：贵州汉方制药有限公司，批号：国药准字H20020272。

1.1.3 细胞株 高转移人巨细胞肺癌细胞系A549细胞株，购自山东省医学科学院细胞室。

1.1.4 药物与试剂 RPMI1640培养液：赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，规格：500 mL/瓶，批号：NVE0268；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：150701；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，原产Amresco，北京Solarbio灌装；L-谷氨酸胺，原产Amresco，北京Solarbio灌装；青霉素、链霉素，华北制药有限公司；噻唑兰（MTT），北京Solarbio科技生物公司，规格：250 mg/瓶，批号：M8180；二甲基亚砜（DMSO），武汉博士德生物工程有限公司；台盼蓝：广州威佳生物有限公司，使用前用PBS缓冲液配成1%溶液。

1.1.5 实验仪器 CO2培养箱（BB5060UV 型）、鼓风干燥箱（热空气Sut6型）、超纯水系统（sgavplus型），均为德国Heraeus公司产品超净工作台，ClassⅡ2085型，美国Thermo Forma公司；低速自动平衡离心机，DT5-3型，北京时代北利离心机有限公司；电子分析天平：ME235P，北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热恒温水浴箱，SGSY2-11型，北京医疗设备有限责任公司；电热压力蒸汽消毒器，YXQG02型，山东安得医疗科技有限公司；倒置相差显微镜，1X50S8F型，日本 Olympus公司；自动酶标记数仪，2010型，郑州博赛生物工程有限责任公司；可调式移液器，Thermo型，热电（上海）仪器有限公司；细胞计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司；凝胶成像分析系统，美国Alpha公司，型号 2200；细胞培养瓶（25cm）、冻存管，均为美国 Corning公司产品；细胞培养板（6孔、96孔）、一次性无菌过滤器（0.22 μm），均为美国 Costar公司产品；扭力天平，上海第二天平仪器厂，TN型。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 高转移人肺癌A549细胞 2×105/mL接种于含15%胎牛血清和含1%的青霉素、链霉素RPMI1640完全培养液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，隔日传代1次。传代后接种于培养瓶中，每瓶细胞数1×105/mL。细胞生长至3 d左右，在倒置相差显微镜下观察，如细胞长满贴壁，即可传代。在无菌操作台中操作，用吸管吸去培养瓶中旧的培养液，并换用新的无菌吸管吸取0.25%胰蛋白酶液2 mL，当细胞间隙变大，细胞形态变圆时取新吸管小心吸弃胰蛋白酶液，加入2～3 mL PBS液，轻轻转动培养瓶，小心吸弃PBS液。加入培养液后用吸管吸取培养液轻轻吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液。用细胞计数板在显微镜下计数，取实验所需细胞数分装入新培养瓶，添加培养液或各实验用药适量，置于37℃、5%CO2饱和湿度的CO2细胞培养箱中进行无菌培养，隔天传代1次，实验时取对数生长期细胞。

1.2.2 含药血清的制备 取雄性SD大鼠 35只，体质量250～300 g，随机分为正常对照组10只，含药血清制备组25只，含药血清组给予夏枯消瘤丸4 mL/次，2次/d灌胃，正常对照组每日给予等量生理盐水灌胃，于给药第3天最后1次灌药1 h后，戊巴比妥钠麻醉，10 min后腹主动脉及心室采血，无菌分离血清，经56℃，30 min灭活处理，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后分装入小瓶，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 细胞悬液的制备及分组 取对数期生长的人肺癌 A549细胞，经0.25%胰酶消化后加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，接种于培养瓶中，贴壁后置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养24 h。细胞生长旺盛并贴壁后，去掉原培养液，分别加入各组不同浓度的含药血清或含有DDP的培养液于培养箱中继续培养24 h，经0.25%胰酶消化后收集细胞并调整细胞至需要的浓度。分组如下：正常对照组：10%胎牛血清；夏枯消瘤丸不同剂量组：5%含药血清组、10%含药血清组、20%含药血清组；阳性对照组：DDP组；联合治疗组：DDP组+5%含药血清组、DDP组+10%含药血清组、DDP组+20%含药血清组。

1.2.4 MTT配制 避光条件下，配制浓度为5 mg/mL的MTT溶液，磁力搅拌器搅拌30 min，使MTT充分溶解。经一次性0.22 μm无菌滤器过滤后直接分装于 EP 管中，1.5 mL/管，铝箔包裹，-20 ℃保存，临用前4℃解冻。

1.2.5 指标检测

1.2.5 .1 MTT法检测细胞增殖 测定细胞抑制率可以反映药物对细胞增殖的影响。对数增长期的人肺癌A549细胞经胰酶消化后，用计数板细胞计数，以 200 μL/孔（每孔细胞数为 2×104）接种于 96 孔平底培养板中，每组设8个复孔，共分6组，右下方剩余孔作为调零孔组，不加细胞仅加入 1640培养液200 μL，余则加细胞悬液。各组接种细胞后置于 37℃、5%CO2饱和湿度的 CO2培养箱中无菌培养，培养 24 h，至细胞生长旺盛贴壁后，去掉原培养液，换成以上分组实验用药，加样后分别继续培养24 h、48 h，于实验结束前4 h吸去上清，加入5 g/L MTT 20 mL，37℃孵育4 h，吸尽上清，加入100 μL二甲基亚砜振荡10 min，沉淀溶解完全后用自动酶标比色仪在波长490 nm处读取吸光值（A490）。

1.2.5 .2 观察人肺癌 A549细胞细胞形态及生长状态 经上述处理的各组细胞培养 24 h后，去除原培养液，用 PBS 2 mL轻轻清洗 2次；以甲醇∶醋酸（3∶1），每孔加 2 mL，固定 30 min；Giemsa染液与 PBS以 1∶9混合成工作液（现用现配），滤纸过滤后染色10～30 min，自来水冲净多余染液，至背景干净为止，晾干后于倒置相差显微镜下观察。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 夏枯消瘤丸含药血清对人肺癌A549细胞增殖的影响

结果见表1。

2.2 肺癌A549细胞细胞形态及生长状态

正常对照组的人肺癌 A549细胞培养 24 h后在镜下见其贴壁生长旺盛，邻近细胞生长融合成片，胞浆饱满，细胞轮廓清晰，细胞外型呈梭形或多角形，铺展良好；加用含药血清后的人肺癌A549细胞，24 h后观察可见细胞渐变圆突起，细胞间连接松弛，增殖速度变慢，逐渐由贴壁而脱落，且随浓度的增加而脱落更明显，脱落细胞悬浮于培养液中，细胞形态变圆或形态不规则，细胞中颗粒增多，部分细胞胞膜尚完整，颜色加深，折光性增强，部分细胞结构不完整，细胞碎裂。结果显示：从形态学上直接观察细胞生长状态，各含药血清组均可破坏人肺癌A549细胞的正常形态，阻碍其增殖生长；含药血清对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用与含药血清的浓度呈正相关，与DDP联合用药有协同作用。倒置相差显微镜高倍镜下可见正常对照组人肺癌 A549细胞胞浆饱满，细胞轮廓清晰，细胞外型呈多角形，铺展良好，细胞生长旺盛，相邻细胞生长晕融合成片；5%、10%、15%含药血清组、DDP组、10%含药血清+DDP组可见部分细胞膜皱缩，细胞核染色质浓集，核固缩，细胞胞浆内有空泡变性，核碎裂，即出现凋亡细胞；并可见凋亡细胞随含药血清浓度增高而增多。24 h镜下观察显示随含药血清浓度增高，凋亡细胞增多，细胞形态改变明显。

3 讨 论

肺癌是恶性肿瘤死亡的首要原因，约占全世界所有癌症死亡人数的1/3。近年来，世界上很多国家的肺癌发病率和死亡率呈急剧上升趋势。2002年全世界的肺癌新病例大约为135万，死亡118万，居恶性肿瘤第1位［1］。根据我国居民死因调查的结果，肺癌死亡率从20世纪70年代中期至90年代初期的20年增加近1.5倍，是增长最快的恶性肿瘤［2］。肺癌作为恶性肿瘤死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（non-smallcelllung cancer，NSCLC）在肺癌中约占80%～90%，严重威胁人类健康。目前治疗多数是以手术、化疗、放疗为主，常用抗肿瘤药物的临床疗效有限，且抗瘤药物的诸多毒副作用如骨髓抑制、消化道反应等会严重影响肿瘤患者对化疗的耐受性和依从性。因此，寻找高效低毒的治疗药物成为近年来肿瘤基础和临床研究的热点。

表1 夏枯消瘤丸含药血清对人肺癌A549细胞增殖的影响 （±s）

表1 夏枯消瘤丸含药血清对人肺癌A549细胞增殖的影响 （±s）

注：与 10%正常对照组比较，1）P＜0.05

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本研究以探寻中医药治疗肺癌的高效低毒途径为出发点，探讨夏枯消瘤丸含药血清对人非小细胞肺癌A549的作用机制。夏枯消瘤丸源于山西名老中医门纯德先生自拟方［3］。药物组成：夏枯草 150 g，生白芍 10 g，元参 15 g，川贝母 15 g，三七 4 g，花蕊石 6 g，山甲珠 3 g，莪术 6 g，煅牡蛎15 g，白花蛇舌草 10 g，露蜂房 6 g，三棱 6 g，两头尖4 g，主要用于多类肿瘤，症见咽干，舌红，脉弦滑者，多以肝肾阴亏为主，肝火郁结，灼津为痰，痰火凝聚，导致气滞血瘀，久而痰瘀互积，内结坚癖。方中以夏枯草为主清肝火，散郁结；生白芍养肝阴，缓急痛；元参、牡蛎、川贝母清热化痰，软坚散结；三棱、莪术、两头尖、山甲珠破血通络、活血化瘀；配伍三七既有活血之用，又有止血消肿之功，使瘀血破散，而不致妄行；花蕊石、露蜂房、白花蛇舌草软坚散结、消瘀化滞。诸药合用，养阴清热、活血破瘀、软坚散结、消痰除癥。

实验中采用的MTT比色法是一种非常经典的检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（浅黄色）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于很多生物活性因子的活性检测、大规模的药物筛选、细胞毒性试验等，它的特点是灵敏度高、经济。本实验结果证明，夏枯消瘤丸含药血清对A549细胞增殖有明显的抑制作用，并随着血药浓度增大而抑制作用也随之增强，不过效果不如DDP单用明显。此外，夏枯消瘤丸含药血清与DDP合用，抑制作用进一步增强，随着作用时间延长，夏枯消瘤丸对 A549细胞增殖的抑制作用有增强趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究课题依托名老中医经验，经初步临床验证与实验研究，证实其可靠性与有效性，结合恶性肿瘤目前的发病趋势与死亡率，为肿瘤医学研究提供了新的方向与靶点。