西藏青稞酒酿造小曲微生物多样性分析

张晓蒙,李德美,金玮鋆,宋 涛,张玉红*,王姗姗,全 莉,闫寅卓,薛 洁

(1.中国食品发酵工业研究院有限公司,北京 100015;2.酒类品质与安全国际联合研究中心,北京 100015;3.北京农学院 食品科学与工程学院,北京 102206;4.西藏自治区农牧科学院 农产品开发与食品科学研究所,西藏 拉萨 850032;5.新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

以青稞为原料,通过特有的酿造工艺,利用青稞酒酒曲发酵酿制而成的青稞酒,口感清香甘甜,醇厚爽口,是西藏地区迎亲送友、聚会庆典必不可少的发酵饮品[1]。随着社会的发展和西南地区经济转型升级的需要,作为地区特色,传统青稞酒的商品化需求日益增大。然而目前,藏地大多青稞酒仍为作坊式生产,青稞酒酒体品质良莠不齐,制约着青稞酒产业的发展。

酒曲是中国酒酿造的糖化、发酵和生香剂,含有多种微生物及其产生的酶,其品质对酒的产率和品质有极大的影响,故有“曲是酒之骨”之称[2]。酒曲中微生物的种类及其代谢酶类随其地域、环境、曲块部位和制曲工艺的不同而存在差异[3],目前,对西藏地区青稞酒酒曲微生物多样性的研究中,郭小芳等[4]采用传统微生物研究的方法自西藏6个地区的9份民间青稞酒酒曲中分离、纯化得到67株霉菌;赵东[5]将传统培养和变性梯度凝胶(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)两种方法相结合,对青稞酒酒曲中的真菌、细菌、有害菌进行了研究,自青稞酒酒曲中分离得到真菌10个属、共13个种,细菌9个属、共22个种,更系统的对西藏青稞酒酒曲微生物多样性进行了分析。前人虽对西藏地区的青稞酒酒曲样品的微生物多样性进行了分析,但分析酿酒用曲微生物的方法主要为传统培养方法结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、非培养方法(变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时荧光PCR技术和荧光原位杂交技术(fluorescencein situ hybridization,FISH)等),这些技术乃能检测出一定丰度以上的细菌或特定微生物[6-8],工作量巨大,而且费力、耗时,且结果可靠性差,并未着重对比分析不同青稞酒酒曲的特点及其差异。而高通量测序技术可谓是传统测序技术的一次革命性改变[9],该测序方法具有通量高、测序周期短以及准确率高等优点[10],可以采集到丰度很低的微生物数据。

因此,本研究基于高通量测序技术对西藏5个地区共21种青稞酒酿造小曲微生物多样性进行分析研究,并对比分析各地区间微生物群落差异,为建立西藏自治区酿酒微生物菌库、青稞酒标准化酿造以及优良微生物的筛选奠定基础,对分析西藏各地区青稞酒酒曲微生物差异具有极大地意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

西藏青稞酒酒曲样品:共21种,均由西藏自治区农牧科学院提供,样品信息清单见表1。

表1 西藏青稞酒酒曲样品信息Table1 Informations of Tibet highland barley wine Jiuqu samples

1.1.2 化学试剂

Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒(MP)、琼脂糖:西班牙Biowest Agarose公司;NGS-ITS1 copy1 Barcodel-70、NGS-16s V4 copy1 Barcodel-70:上海生工生物工程技术服务有限公司;Gold View I核酸染料:北京中生瑞泰科技有限公司;DL2000Marker、AxyPrep脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)凝胶回收试剂盒:美国Axygen公司。

1.2 仪器与设备

IlluminaMiseq测序仪:美国Illumina公司;BG-Power600电泳仪:北京百晶生物技术有限公司;Biosystems Model温度梯度PCR仪:美国伯乐公司;Tanon1600凝胶成像仪:美国伯乐公司;BioSpec-nano核酸蛋白检测仪:德国Eppendorf公司;2-16N高速微量离心机:湖南恒诺仪器设备有限公司;Mini-beater组织研磨器:美国Biospec公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞酒酒曲总DNA的提取[5,11-12]

菌体分离及总DNA的提取:分别取21种青稞酒酒曲样品2g于50mL离心管中,记为管1,每个离心管中加入10mL磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffer saline,PBS),振荡5 min,形成菌体悬浮液;2 000×g离心5 min,将上清液转移到新的50 mL离心管中,记为管2;向管1中加入10 mL的PBS,振荡1 min,2 000×g离心5 min,之后再将其中的上清液转移到管2中;重复步骤向管1中添加PBS,直至转移到管2的上清液变澄清为止;以9 000×g对管2离心10 min,取沉淀,即为青稞酒酒曲中的微生物菌群。

采用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒进行DNA的粗提。

1.3.2 PCR扩增[13-14]

取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组脱氧核糖核酸为模板,根据测序区域的选择,对样品进行ITS的ITS1区及16SrDNA的V4区域进行PCR扩增。

PCR反应体系:10×PCRbuffer 2.5μL;脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)mix 2μL;Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL;DNA模版1μL;上下游引物各1μL;补双蒸水至50μL。

真菌ITS的ITS1区域扩增通用引物:ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

细菌16SrDNA V4区域扩增通用引物:515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

真菌PCR扩增条件:98℃预变性3 min;98℃变性45 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,反应35个循环;72℃再延伸8 min,-20℃保存。

细菌PCR扩增条件:95℃预变性3 min;95℃变性45 s,50℃退火30 s,72℃延伸45 s,反应35个循环;72℃再延伸5 min,-20℃保存。

1.3.3 PCR扩增产物的检测、纯化及混样

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测;使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对真菌、细菌的PCR扩增产物进行切胶回收(纯化);根据纯化后的PCR产物浓度进行等浓度混样。

1.3.4 高通量测序[15-17]

采用Illumina Misq高通量测序平台进行文库构建和上机测序,采用QIIME(V1.7.0)软件对下机数据进行生物信息学分析,采用R语言绘图。

1.3.5 主成分分析

根据高通量测序物种注释结果,采用加权组平均法,计算协方差矩阵,得到特征值及特征向量,计算主成分载荷因子,得到主成分载荷矩阵,对21个样品的真菌、细菌群落进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.3.6 数据处理方法

采用Excel 2013、Uparse和SIMCA软件,对原始数据进行处理和图表编辑。

2 结果与分析

2.1 西藏不同地区青稞酒酒曲样品OTU比较分析

2.1.1 OTU数目分析

为了研究西藏自治区5大地区共21种青稞酿造小曲样品中物种组成的多样性,采用Uparse软件对所有样品的全部Effective Tags(过滤后得到的拼接序列总数)序列进行聚类分析,以97%的一致性(identity)将序列聚类成操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)。通过比较不同样品的OTUs数目,可初步说明样品中物种的丰富程度。在OTUs构建过程中,对不同样品的Effective Tags、Taxon Tags(用于构建OTUs并且获得分类信息的Tags数目)、Unclassified Tags(用于构建OTUs但没有获得分类信息的Tags数目)、Unique Tags(频数为1,并且无法被聚类到OTUs的Tags数目)、OTUs(最终得到的OTUs数目)等信息进行初步统计,得到21种不同西藏青稞酒酒曲样品的真菌、细菌的Tags和OTUs数目,结果见图1。

由图1(A)可知,林芝朗县(XZ1)、昌都江达县(XZ16)、山南(XZ19、XZ20)和拉萨曲水县(XZ21)地区的真菌OTUs值及昌都洛隆县(XZ9～XZ15)地区平均OTUs值高于整体样品平均值,说明真菌种类较为丰富;由图1(B)可知,日喀则教武场、山南和拉萨曲水县地区细菌OTUs值及林芝、昌都洛隆县地区平均OTUs值高于整体样品平均值,说明细菌种类较为丰富。由此得出,林芝朗县地区、山南地区、拉萨曲水县和昌都洛隆县地区的青稞酒酒曲微生物种类相对丰富,昌都贡觉县、昌都城区和日喀则地区青稞酒酒曲微生物种类相对较少。

图1 21种西藏青稞酒酒曲样品真菌(A)、细菌(B)的Tags和OTUs数目统计Fig.1 Statistics of the number of Tags and OTUs of fungi(A)and bacteria(B)in 21 kinds of Tibet highland barley wine Jiuqu

2.1.2 OTU分类分析

按所有样品间序列的最小值对OTUs聚类结果进行标准化处理,根据OTUs聚类分析结果,分析不同样品(组)之间的OTUs的共有、特有信息,得到不同样品(组)之间的OTUs的分类学信息,并绘制韦恩图(Venn Graph),结果见图2。

图2 不同样品组中真菌(A)和细菌(B)群落的维恩图Fig.2 Venn graph of fungi(A)and bacteria(B)communities in different sample groups

由图2(A)可知,林芝、日喀则、昌都、山南和拉萨地区青稞酒酒曲样品中真菌的种类依次为109、83、130、140和108种。根据共有菌种数目,得到五个地区真菌共有菌种、特有菌种与总菌种的比例,结果如表2所不。

表2 西藏不同地区青稞酒酒曲样品中共有和特有真菌的占比Table2 Proportion of common and unique fungiin highland barley wine distiller's yeast samples from different Tibet regions

由表2可知,与日喀则、林芝和拉萨地区比较,山南(22.1%)和昌都(18.5%)地区特有菌种占比较大。其中,昌都、山南和拉萨曲水县地区共有种类为97种,相比其他地区青稞酒酒曲真菌种类较为接近。

由图2(B)可知,林芝、日喀则、昌都、山南和拉萨地区青稞酒酒曲样品中细菌的种类依次为967、801、880、817和753种,其细菌共有菌种、特有菌种与总菌种的比例如表3所不。

表3 西藏不同地区青稞酒酒曲样品中共有、特有细菌的占比Table3 Proportion of common and unique bacteria in highland barley wine Jiuqu samples from different Tibet regions

由表3可知,西藏五个地区青稞酒酒曲样品均含有本地特有的细菌菌种,特有菌种占比介于3.6%～21.9%,其中昌都(15.8%)和林芝地区(21.9%)青稞酒酒曲细菌特有菌种的占比更大;除共有菌种、特有菌种外,西藏各地区青稞酒酒曲样品之间含有较真菌(最高140种)更多的共有细菌(最高967种)。其中,山南和拉萨地区共有种类为691种,相比其他地区青稞酒酒曲细菌种类较为接近。

2.2 西藏不同地区青稞酒酒曲样品微生物丰度分析

通过高通量测序物种注释结果可知,21个青稞酒酒曲样品中共检测出真菌140个种、69个属,属于4个菌门,分别为子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota);检测出细菌967个种、309个属,属于9个菌门,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes),且还包括一个古生菌门,奇古菌门(Thaumarchaeota)。以物种的丰度＞1%作为划分依据,选取在属分类水平上相对丰度前10名的真菌、细菌菌属进行分析,以相对丰度为纵坐标,样品名为横坐标,绘制物种相对丰度柱形图,结果如图3所不。

图3 真菌(A)和细菌(B)群落属水平的相对丰度Fig.3 Relative abundance of fungi(A)and bacteria(B)at genus levels

由图3(A)可知,西藏五个地区青稞酒酒曲样品的共有优势真菌菌属为覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。其中,林芝和山南地区青稞酒酒曲样品中根霉属(Rhizopus)占比较大,平均占比分别为66%和73%。根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)和曲霉属(Aspergillus)的主要作用是代谢产生淀粉酶和蛋白酶,将淀粉、蛋白质降解为还原糖、氨基酸等小分子物质,供酵母生长,并兼具一定的发酵力[18-19]。日喀则、昌都和拉萨曲水县地区青稞酒酒曲样品中覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)占比较大,平均占比分别为78%、89%和85%。覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)属非酿酒酵母,包括伊萨酵母属(Issatchenkia)和兰久浩酵母属(Guehomyces)等,均对青稞酒的风味具有重要作用。

除此之外,山南地区青稞酒酒曲样品中的伊萨酵母属(Issatchenkia)和假丝酵母属(Candida)平均占比分别为其他地区的9倍和22倍。包怡红等[20]研究证明伊萨酵母属(Issatchenkia)能较好的代谢产生胞外多糖,抗氧化能力突出;杜木英等[21]指出假丝酵母属(Candida)可产生淀粉糖化酶而水解淀粉,且发酵产物对青稞酒的风味产生重要影响。山南和拉萨曲水县地区的异常威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)的平均占比分别为其他地区的19倍和25倍。且在拉萨曲水县地区检出特有真菌菌属兰久浩酵母属(Guehomyces)。宋春丽[22]在南极海洋泥样品中分离鉴定出一株隶属兰久浩酵母属(Guehomyces)的真菌,并验证了其高产乳糖酶性及耐冷性。

此外,林芝朗县、日喀则藏式街、昌都洛隆县和昌都城区的曲霉属(Aspergillus)为优势菌属,占比均在0.15%以上,为其他地区的8倍以上。昌都地区特有真菌菌属为篮状菌属(Talaromyces)。林芝朗县和山南地区检出了含量很低的青霉属(Penicillium),青霉属(Penicillium)的某些种可代谢产生赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)[23],为酒曲中的有害菌。故应着重注意发酵工艺及条件,避免该菌种代谢产生毒素。

由图3(B)可知,西藏五个地区青稞酒酒曲样品的共有优势细菌菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。其中,乳酸杆菌属(Lactobacillus)在昌都各地区的相对丰度值的平均占比在90%以上;林芝和日喀则地区次之,平均占比约为50%左右;山南和拉萨曲水县最少,平均占比在20%以下。明串珠菌属(Leuconostoc)在林芝和日喀则地区相对丰度值较大,占比平均值约为30%。此外,林芝、日喀则、昌都洛隆县和昌都城区的片球菌属(Pediococcus)平均占比均为其他地区的4倍以上,其中日喀则为16倍。昌都洛隆县、昌都城区、山南和拉萨曲水县的魏斯氏菌属(Weissella)平均占比为其他地区的35倍以上,其中昌都城区最高,为170倍。林芝朗县和日喀则城区优势菌属有乳球菌属(Lactococcus),在日喀则城区样品中占比较大,约为10%。上述所提菌属均为乳酸菌,可在发酵初期制造酸性环境,产生胞外多糖,并代谢产生乳酸和乙酸[24-26],在直接影响酒类风味的同时,还可与乙醇作用产生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质,赋予青稞酒饱满的香气[27];除了对风味的影响,乳酸菌可通过产生有机酸、竞争营养成分、产生乳酸菌素等途径抑制食源性致病菌[28-31]。此外,有文献报道[5],部分乳酸菌对酿酒过程是不利的,也需要对这些不利于酿酒发酵的群落加以控制和筛选。故应辩证的研究青稞酒酒曲中的乳酸菌,加以控制及改良。

山南和拉萨曲水县优势菌属有慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和不动杆菌属(Acinetobacter),其中,慢生根瘤菌属占比为65%以上。昌都贡觉县、昌都城区、山南和拉萨曲水县的芽孢杆菌属(Bacillus)平均占比较高,其中昌都贡觉县占比为2.2%,几乎为其他地区的100倍。在昌都洛隆县检出了含量很低的假单胞菌属(Pseudomonas)。芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)等,可通过调节根围土壤中生物群落,活化土壤养分、改善理化特性、促进作物生长发育、增加作物产量和改善品质[32]。朱丹[33]通过对青稞土壤施用微生物有机肥,改善土壤微生物群落结构多样性,从而证明芽孢杆菌属(Bacillus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)等对土壤的固氮作用。有资料表明,酵母菌的氮代谢对酒的风味品质有重要影响[34],且芽孢杆菌属的某些种是生成酒体芳香类物质的菌源[35]。由此得出,从细菌角度,在酿制风味品质较高的青稞酒产品方面,山南和拉萨曲水县地区的青稞酒酒曲比较有优势。

2.3 西藏不同地区青稞酒酒曲样品微生物群落主成分分析

将西藏五大地区青稞酒酒曲样品的真菌、细菌群落信息整合,采用SIMCA软件,对西藏五大地区青稞酒酒曲样品的微生物群落进行主成分分析,结果如图4所不。

图4 不同青稞酒酒曲样品微生物群落的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of microbial communities in different highland barley wine Jiuqu samples

由图4可知,当PC1为53.2%,PC2为36.7%时,林芝与日喀则地区、昌都地区、山南地区、拉萨地区分别独立呈现于主成分分析图上,有着清晰地界限(P＜0.05)。其中,山南地区样品与其他地区距离最远,差异性最为显著(P＜0.01);林芝米林县与日喀则各地区样品微生物群落距离较为接近,差异性不明显(P＞0.05)。在各地区内部样品间也存在一定差异:林芝朗县样品与林芝米林县样品距离较远,存在一定差异(P＜0.05);昌都江达县、贡觉县、洛隆县样品之间微生物群落信息无明显差异(P＞0.05),而昌都城区则与昌都其他村县样品呈现一定的差异性(P＜0.05)。

3 结论

本研究对西藏自治区林芝、日喀则、昌都、山南和拉萨五个地区共计21个青稞酒酿造小曲样品中的微生物多样性进行了分析。结果表明,西藏五个地区的青稞酒酒曲样品中共有菌种较多,但不同地区均拥有一定比例的特有菌种,各地区间的共有菌种数目不同;昌都、山南、拉萨曲水县和林芝地区青稞酒酒曲微生物种类相对丰富,日喀则地区青稞酒酒曲微生物种类相对较少;群落维恩图和微生物丰度属水平分析表明,西藏五个地区青稞酒酒曲样品的共有优势真菌菌属为覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor),优势细菌菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。主成分分析说明,各地区青稞酒酒曲样品微生物差异性显著且各地区不同村县的青稞酒酒曲样品也存在一定差异(P＜0.05)。