膝骨关节炎模型大鼠相关穴位敏化的肥大细胞机制研究*

王巧侠，丁 宁，姜 婧，刘潇潇，秦萍萍，许艺元，胡嘉同，李志刚

(北京中医药大学，北京 100029)

穴位是人体脏腑经络之气输注于体表的特殊部位，是针灸治疗疾病的特殊部位，也是针灸的主要研究对象。穴位由生理状态下的“静息态”转变为病理状态下的“激活态”，并实现接受刺激、调节机体状态的功能即为穴位敏化[1-2]。

肥大细胞(Mast Cells,MC)是重要的免疫细胞，研究发现MC在穴位敏化中扮演了重要的角色[3-5]。在解剖层面上，穴位处于一定厚度的结缔组织中[6-8]。实验研究已经证实MC与经络相关[9]，而在对穴位敏化的机制研究中发现MC与穴位的生物物理特性关系密切[10-12]，研究已经证实了穴位组织切片中有MC[13]，且穴区MC的数量高于非穴区[14-15]。MC与穴位有密切的关系，MC是穴位重要的组织形态学依据，也是穴位功能的重要载体，穴区MC的募集和脱颗粒在组织学上被认为针灸治疗的反应。MC通过针刺释放的炎性介质诱导神经免疫应答来完成效应，此外，这些炎性介质在循环、神经和免疫网络之间有着至关重要的作用[16-18]。目前关于穴位敏化的研究大多聚焦于MC上，但对MC的研究仅限于针刺干预期，重点关注于MC对针刺穴位或者效应器官的反应，从而忽视了不同程度疾病的MC的变化及在穴位敏化过程中MC具体的作用机制。本实验通过研究不同程度膝骨关节炎模型鹤顶穴、阳陵泉及委中穴穴区MC在穴位敏化第7天的形态和功能的变化试说明在疾病的早期，不同程度疾病不同穴位穴区肥大细胞的变化情况及穴位是否致敏以及穴位敏化过程中穴位处的循环、神经、免疫网络机制，帮助理解针刺效应的科学原理，对疾病早期的临床诊断和治疗有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级SD雄性大鼠40只购自北京斯贝福生物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0002]，体质量150～160 g，饲养于北京中医药大学屏障环境动物室，空气流通，相对湿度60%，12 h昼夜循环光照。适应性饲养1周后，应用随机数字表将大鼠分为正常对照组(N)、生理盐水组(NS)、轻度关节炎组(A)、中度关节炎组(B)和重度关节炎组(C)5组，每组各8只。

1.2 主要试剂及仪器

单碘乙酸盐(MIA)和水合氯醛(购于欧北生物科技有限公司);全自动组织脱水机(ASP300S，德国徕卡仪器有限公司);半自动轮转式切片机(RM2245，德国徕卡仪器有限公司);自动化智能型正置研究级显微镜(BX53奥林巴斯有限公司)、冰冻切片机(Leica Corpora-tion，Germany);激光共聚焦扫描显微镜(FV1000，Olympus Corporation，Japan)。

1.3 模型制备

采用Guingamp C等[19]的经典MIA造模方法来制备膝骨关节炎大鼠模型，将MIA溶液注入大鼠右侧膝骨关节腔内，并配合持续的抽屉样关节运动。具体操作步骤为：将MIA溶入到50 μL 9%的生理盐水中，大鼠用水合氯醛麻醉(10%，0.04 mL/g，腹腔注射)后，清理关节附近的鼠毛，将关节屈曲到最大限度后于右膝关节腔注入配置好的药液，A、B、C组大鼠分别注射0.3、1、3 mgMIA，NS组用同样的方法于右侧膝关节腔内注入50 μL 9%的生理盐水，N组则不做处理。

1.4 取材

于造模后的第7天，将各组大鼠进行腹腔麻醉，每组选取6只大鼠采用甲苯胺蓝染色法来观察穴区局部MC的募集和脱颗粒，另外2只采用免疫荧光染色技术来观察穴区局部相关分子的表达。

1.4.1 甲苯胺蓝染色 将动物处死后，分别以鹤顶穴、阳陵泉穴和委中穴为中心取1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm体积大小的标本(包含皮肤及皮下结缔组织)，经10%中性福尔马林溶液固定48 h后，使用组织脱水机进行脱水，采用石蜡包埋方法，进行组织切片的制作，切片厚度为4 μm，切片方向为皮肤组织块纵切面，随后将各部分进行脱蜡、脱氢和染色，采用0.5%甲苯胺蓝染色30 min，自来水冲洗，二甲苯透明，中性树胶封固。

于自动化智能型正置研究级显微镜上进行图像拍摄，拍摄倍数为10×40，每张切片随机选取6个不重复视野，计算MC数量平均值，并记录穴区MC脱颗粒情况，计算MC脱颗粒率及MC轻度和重度的脱颗粒率[20]。肥大细胞脱颗粒率=脱颗粒的肥大细胞数/肥大细胞总数×100%。

1.4.2 免疫荧光染色 采用水合氯醛(10%，0.04 mL/g，腹腔注射)每组麻醉2只大鼠，并用4%多聚甲醛灌注。以鹤顶穴、阳陵泉和委中穴为中心取1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm体积大小的样本(包含皮肤及皮下结缔组织)，将样本在4%多聚甲醛中固定2.5 h，并用25%蔗糖脱水2天。在-25℃下用冷冻切片机制备10 μm厚度的切片。一抗包括小鼠单克隆肥大细胞类胰蛋白酶抗体(1∶100，Abcam，USA)，山羊多克隆5-羟色胺(5-HT)抗体(1∶100，Abcam，USA)和兔多克隆组胺(HA)抗体(1∶200，LSBio，USA)。驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(1∶200，Abcam，USA)、驴抗山羊IgG Alexa Fluor 594(1∶200，Abcam，USA)和驴抗兔IgG Alexa Fluor 594(1∶200， Abcam，USA)用作相应的二抗。使用溶液4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，Solarbio，Beijing，China)进行反染色。

双重免疫组织化学染色步骤如下：将切片在0.1 MPB(pH = 7.4)中洗涤并在含有3%正常驴血清和0.5%Triton X-100的0.1M PB(pH=7.4)中封闭30 min。滴加用小鼠单克隆肥大细胞类胰蛋白酶抗体和山羊多克隆5-HT抗体于切片上，4℃孵育过夜。 PB洗涤后，在切片避光滴加Donkey抗小鼠IgG Alexa Fluor 488和Donkey Anti-Goat IgG Alexa Fluor 594 2 h。随后，用PB洗涤切片并用DAPI避光染色6 min。用PB洗涤后，封片剂封片，在激光共聚焦扫描显微镜下观察切片。在60倍放大率下记录双重染色的MC数量和它们的脱颗粒程度。使用相同的染色方案进行双重免疫组织化学染色，以检查肥大细胞类胰蛋白酶和HA的共表达。

1.5 数据处理

2 结果

2.1 各组不同穴位穴区MC数量的比较

统计结果可知，同一穴位在不同组别比较，鹤顶穴的A、B、C 3组MC数量均高于N组和NS组(P<0.01)，A、B、C 3组MC数量随疾病程度呈递增趋势。见表1。

表1 各组不同穴位穴区MC数量比较个)

注：与N组比较，aP<0.01；与NS组比较，bP<0.01

2.2 各组MC脱颗粒率比较

不同组别同一穴位比较，A、B、C 3组鹤顶穴MC脱颗粒率随疾病程度加重呈递增趋势，且C组穴区MC脱颗粒率高于N组(P<0.01)、NS组(P<0.01)及A组(P<0.01)。见表2。

表2 各组MC脱颗粒率比较

注：与N组比较，aP<0.01； 与NS组比较，bP<0.01；与A组比较，cP<0.01

2.3 不同程度疾病模型鹤顶、阳陵泉、委中三穴局部MC甲苯胺蓝染色结果

MC成圆形或椭圆形，其核呈圆形，细胞质被嗜碱性紫色颗粒均匀点样。鹤顶穴的一些MC显示大量蓝紫色颗粒分布在细胞之间，排列成束状或带状。见封三彩图1。

2.4 穴位敏化过程中鹤顶穴、阳陵泉和委中穴区局部肥大细胞类胰蛋白酶与5-HT、HA共表达情况

类胰蛋白酶与5-HT和HA共表达情况见于封三彩图2和封三彩图3，为了更好的说明类胰蛋白酶、5-HT、HA三者的表达情况，图片选取了N组和C组作对比。实验结果发现N组和NS组中，5-HT和HA的共表达水平较低。MC的脱颗粒较少，这与甲苯胺蓝染色的结果一致。而在A、B和C组中，在鹤顶穴阳性染色细胞的数量和染色强度(表示类胰蛋白酶、5-HT和HA的表达水平较高)都有所增加。 在A、B和C组中，荧光显示鹤顶穴的一些5-HT、HA和类胰蛋白酶释放到细胞外区域，这与MC脱颗粒的特征相符。 此外，发现鹤顶穴免疫荧光染色的MC的数量，以及它们在A、B和C组的脱颗粒水平，随着疾病严重程度的增加而趋于增加。而阳陵泉穴和委中穴中观察到MC免疫荧光染色三者的共表达程度较低甚至无表达。

3 讨论

穴位不仅是人体脏腑经络气血输注的特殊部位，同时也是疾病的反应点和治疗点[21]。甲苯胺蓝染色分析结果显示，A、B和C组鹤顶穴区MC的数量和脱颗粒率随疾病程度增高而增加，模型组3组MC数量高于N和NS组，而MC颗粒率与N组和NS组存在差异的主要集中在C组，这些结果表明穴位敏化与MC的募集和脱颗粒水平有关。从鹤顶穴数据来看，穴位敏化与疾病程度成正相关，这与Ding N等[18]在14天的研究结果相符。而阳陵泉穴和委中穴，在MC的数量及脱颗粒率水平上没有发生显著变化，尚不能说明这两个穴位在疾病过程中发生了穴位敏化等。可以得出这样一个结论，穴位敏化期间MC的功能和形态变化是有穴位的特异性的，由3个穴位的对比可以发现，每个穴位发生敏化的条件是不相同的。而在相同条件下3个穴位之间的对比可以发现鹤顶穴区的MC数量及脱颗粒率要高于其他两穴，说明鹤顶穴在造模后的第7天发生了敏化，且相较于阳陵泉穴和委中穴更容易敏化。由A、B、C 3组的对比可以看到，MC脱颗粒程度与疾病程度成正相关。

近年来对于穴位敏化过程中MC的募集和脱颗粒率变化机制主要集中在神经纤维和血管的结构上，课题组成员前期研究[18]结果提出MC的这种变化可能是循环系统、神经系统和免疫系统3个系统之间复杂的相互作用的结果的假说。本试验在此研究基础上，对膝骨关节炎第7天时穴位局部进行研究发现，穴位发生敏化的过程中，MC发生了募集和脱颗粒的变化，免疫荧光实验显示MC脱颗粒释放的类胰蛋白酶的表达增加，并且在敏化过程中5-HT、和HA的表达也随疾病程度的加重而增加，证实了5-HT和HA在穴位敏化过程中的正向表达。

膝骨关节炎(KOA)隶属中医学“筋痹”“骨痹”“痹症”等范畴[22]，其病因病机为肝肾亏虚及长期劳损，导致筋骨失养，血瘀气滞膝部，其病理表现主要为骨及软骨的退行性变化，关节软骨进行性缺失，软骨下骨的坏死及由此引起的骨及软骨的修复反应[23]。实验中选用关节软骨的病理切片来验证模型制备是否成功。基于Guzman等[24]研究发现用MIA造模后的第7天,软骨下骨组织中的破骨细胞和成骨细胞发生变化，和Beyreuther等[25]发现在造模后的第5天大鼠膝关节发生炎症反应，故实验中选取造模后第7天作为研究的时间点来观察MC的变化过程。

针灸治疗膝骨关节炎是经过大量的临床实践总结，选穴方法成熟，疗效显著，可以缓解膝骨关节炎患者的疼痛并改善膝关节的功能，较其他物理疗法效果显著[26]，敏化态的穴位能作为疾病在体表的反应部位对治疗有较高的敏感性，选用易敏化的穴位作为治疗穴位具有更高的临床价值[27-28]。临床上针灸治疗膝骨关节炎主要选择膝关节周围的穴位、足阳明胃经的穴位及经外奇穴等。鹤顶主治下肢瘫痪、鹤膝风等；委中穴对于膝部疼痛有很好疗效[29]；段权等[30]通过研究腧穴的热敏化规律发现阳陵泉、鹤顶穴发生热敏化的频率较高。故本试验选取了鹤顶、阳陵泉、委中穴作为穴位研究对象，并按照《实验针灸学》[31]取穴。

本实验在数据统计中，发现鹤顶穴MC数量和脱颗粒率的变化并不是完全一致的，究其原因可能是随机选择的视野中差异较大，样本量不够大，后续实验结果统计时可适当增加样本量，将这些误差控制在较小的范围中。

综上所述，不同疾病程度的不同穴位在穴位敏化中MC的形态和功能发生了变化，MC的募集和脱颗粒率与疾病程度成正相关，且穴位的敏化具有位置的特异性，这对膝骨关节炎的早期临床诊断和治疗有指导意义。本研究证实穴位发生敏化时穴位处的MC释放了类胰蛋白酶、5-HT、HA物质，MC释放这些物质可能是穴位发生敏化的细胞分子机制。