三穴五针对哮喘大鼠肺组织中Eotaxin、RANTES表达的影响*

魏 旭，韩君萍，虞跃跃，李 双，赵 叶，杨金华，崔建美

(华北理工大学，河北 唐山 063000)

支气管哮喘是当今社会常见的慢性疾病之一，是一种以多种炎症细胞和一系列细胞因子参与为特征的气道慢性炎症性疾病[1]。临床表现为呼气性呼吸困难、反复发作性喘息、咳嗽或胸闷等症状，每于夜间和(或)清晨发作。据世界各国流行病学调查结果显示，目前全球约有3亿哮喘患者，其中儿童患病率在3.3%～29%，成人患病率在1.2%～25.5%[2-3]，被世界卫生组织列为四大顽症之一。针刺防治哮喘疗效确切，副作用小，费用相对较低，逐渐成为我国防治哮喘的特色之一。邵氏“三穴五针法”由邵经明教授所创，即以双侧肺俞穴、风门穴及单穴大椎为主穴的针刺疗法[4-5]，邵氏“三穴五针法”是在多年的临床实践与研究中总结而成的治疗方法，在治疗哮病的临床应用中效果显著[6-7]，然而其治疗哮喘的作用机制尚未完全明确[8]。本实验采用HE染色法、免疫组化法等观察“三穴五针法”针刺对支气管哮喘大鼠肺组织病理改变及Eotaxin、RANTES的影响，以探讨“三穴五针法”治疗哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠30只(购自天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号：SYXK2015-0038)，雄性，(120±10)g。大鼠饲养于华北理工大学实验动物中心屏障环境，动物实验设施(使用证明：MY10DXK07)，温度设定20℃～25℃，湿度设定60%～70%。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》(2006)的相关规定。

1.2 试剂和仪器

卵蛋白(A5503-10G，美国Sigma公司)；兔抗大鼠Eotaxin抗体(A7569，abclonal)；山羊血清(792740，Blological Industries)；兔抗大鼠RANTES抗体(A5630，abclonal)；兔抗大鼠荧光二抗(100944，KPL)；DAPI(035M4029V，SIGMA)；雾化吸入器(085G3005，德国PARI)；生理记录仪；切片机(RM223型，德国莱卡)；一次性无菌针灸针(华佗牌)；荧光防淬灭封片剂(150529，KPL)；酶标仪(M200PRO，TECAN)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 将30只SD大鼠(SPF级)随机分为3组，每组各10只，具体分组如下：①正常对照组：用生理盐水代替卵蛋白(OVA)；②哮喘模型组：按大鼠哮喘模型制备方法进行造模，但不给予针刺处理；③针刺干预组：自造模之日起采用“三穴五针法”给予针刺处理。

1.3.2 制备哮喘大鼠模型 哮喘模型组及针刺干预组SD大鼠腹腔注射生理盐水配制的卵蛋白(OVA)悬液1 mL[含1 mg卵蛋白(OVA)和10 mg Al(OH)3凝胶]，并于第8天重复注射1次，第9天开始用1%OVA混悬液雾化吸入激发，每次30 min，每日1次，激发4周。正常对照组大鼠腹腔注射及雾化吸入相同剂量的生理盐水，且时间地点与哮喘模型组保持一致[9]。

1.3.3 “三穴五针法”针刺干预 自造模之日起开始针刺，穴位选取大椎、双侧风门和双侧肺俞，进针后予以平补平泻手法，5 min行针1次(捻转速度200次/min，捻针20次为行针1次)，留针20 min，隔日1次，共针刺4周。

1.3.4 气道阻力与肺顺应性测定 用10%的水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，将气管和食管切开后插管，然后用数据记录分析系统连接(上海医科大学生理实验室提供)记录供测定潮气量(VT)、气流速率(V)和呼吸频率。经计算机图像、数据分析处理得到气道阻力(R)和肺顺应性(C)。

1.3.5 肺组织病理学观察 3组大鼠分别检测气道阻力后，迅速结扎大鼠右肺中叶，右心室头皮针插管并在左心耳剪开一切口，用无菌生理盐水快速行肺循环灌注至双肺苍白色。将心肺和气管完整取出，剥离肺，生理盐水漂洗干净，吸水纸拭干。剪出结扎的右肺中叶，进行HE染色：4%多聚甲醛固定肺组织标本，24 h后清水冲洗过夜，梯度乙醇脱水、透明，浸蜡组织，石蜡包埋，连续切片(4 μm厚度)。HE染色后显微镜下观察炎性细胞的浸润及肺组织结构的病理改变。

1.3.6 免疫组化检测肺组织中Eotaxin、RANTES蛋白的表达 将石蜡切片按以下步骤操作：①65℃烤片机上烤片40 min，室温放置5 min；②进项常规石蜡切片脱蜡后，放入纯水中2 min；③放入微波炉中高火煮沸后，将玻片放入插槽中，改中火7 min进行高温修复；取出后室温30 min冷却后，PBS洗涤5 min×3次；④H2O2(消除内源性过氧化物酶)放在湿盒中15 min过PBS 3 min×3；擦片后加入一抗4℃冰箱过夜；⑤拿出湿盒室温孵育1 h后，PBS冲洗2 min×3次；⑥加二抗孵育15 min后，PBS冲洗3 min×3次；⑦DAB(纯水:试剂A:试剂B：试剂C为20∶1∶1∶1)显色7 min；⑧用显微镜观察，备一盆水用于终止染色；终止染色后，苏木素染色3 min后，清水洗2次，镜下观察染色情况来定分化时间；盐酸分化10 s后，流水返蓝30 min；⑨梯度酒精脱水，中性树固封。用Image pro plus6.0软件测量IOD值。

1.3.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差进行描述，多样本均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，满足正态性和方差齐性时，两两比较采用LSD法检验；方差不齐时，选用Dunnett’S T3法检验，检验水准α=0.05。各组数据均用SPSS 17.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 各组肺顺应性和气道阻力肺顺应性比较

哮喘模型组气道阻力较正常对照组明显升高(P=0.015<0.05)，针刺干预组气道阻力较哮喘模型组明显降低(P=0.000<0.05)。哮喘模型组肺顺应性较正常对照组明显降低(P=0.012<0.05)，针刺干预组肺顺应性较哮喘模型组明显升高(P=0.047<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠气道阻力与肺顺应性测定比较

注:与哮喘模型组比较，#P<0.05；与正常对照组比较，*P<0.05；与针刺干预组比较，▲P>0.05

2.2 各组大鼠肺组织病理变化

经HE染色观察显示，哮喘模型组大鼠肺组织可见肺泡内结构损坏，支气管黏液水肿，粘液栓形成，管腔变窄，气道平滑肌肥大增厚，支气管上皮结构不规则、细胞脱落；气道壁及肺间质中大量炎细胞浸润。针刺干预组较模型组肺组织炎症减轻，气管及肺泡形态结构较完整，管腔内偶见分泌物滞留，炎性细胞少量分布，气道平滑肌增厚及狭窄显著好转，与正常对照组较接近。见图1。

2.3 各组大鼠肺组织Eotaxin、RANTES蛋白阳性表达值

哮喘模型组大鼠肺组织Eotaxin、RANTES的表达水平显著高于正常对照组(均P<0.05)，针刺干预组大鼠肺组织Eotaxin、RANTES的表达水平较哮喘模型组明显降低(均P<0.05)。见表2、图2和图3。

表2 各组大鼠肺组织平均IOD值的比较

注:与哮喘模型组比较，#P<0.05；与正常对照组比较，*P<0.05；与针刺干预组比较，▲P>0.05

图1 各组大鼠肺组织病理变化(HE×200)注:箭头所指为气管

图2 各组大鼠肺组织Eotaxin表达

图3 各组大鼠肺组织RANTES表达

3 讨论

现代医学对哮喘发病机制的分析，大多集中在气道高反应、气道炎症及气道重塑等方面[10]。而对哮喘大鼠气道高反应性的评估主要通过观察大鼠肺组织气道阻力及肺顺应性的变化。气道阻力主要指气体通过呼吸道遇到的摩擦阻力，其变化与管腔的半径4次方成反比，所以在哮喘发作支气管收缩时，管腔半径的小变化，就会导致气道阻力发生巨大改变。肺顺应性是测定肺的弹力是否正常的一种方法，能够反映肺的弹性，当气道任一部位发生狭窄或阻塞时可使肺顺应性明显降低[11]。在本实验中，模型组气道阻力较正常对照组明显升高(P<0.05)，针刺干预组气道阻力较哮喘模型组明显降低(P<0.05)。哮喘模型组肺顺应性较正常对照组明显降低(P<0.05) ，针刺干预组肺顺应性较哮喘模型组明显升高(P<0.05)。说明哮喘发作可致气道阻力增加、肺顺应性降低，经针刺后可有效改善气道阻力，增强肺顺应性从而抑制哮喘支气管痉挛收缩,降低兴奋传导。

气道炎症作为哮喘重要的发病机制，与气道高反应性关系密切，嗜酸性粒细胞(EOS)是支气管哮喘气道炎症的关键效应细胞，它在哮喘气道的聚集是哮喘发作的一个中心环节，大多数炎性细胞最终通过EOS产生效应[12]，同时其在气道的浸润与活化也决定了哮喘的严重程度[13]。Eotaxin 是近年来发现的嗜酸粒细胞趋化因子，由嗜酸性粒细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞产生，在肺脏内主要由支气管和肺泡上皮产生，其主要化学作用是吸引EOS在肺内的募集，是一种EOS化学激动剂[14]。且Eotaxin 是唯一一个仅与单一受体CCR-3发生作用而介导EOS从血管迁移至炎症肺组织中的趋化因子，趋化嗜酸性粒细胞向炎症部位聚拢，从而引起局部嗜酸性粒细胞炎症发生[15-17]。调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子(RANTES)是第1个被证实的具有趋化EOS功能的CC趋化因子，在哮喘的早期和后期对嗜酸性粒细胞的趋化起到了重要作用。RANTES主要来源于淋巴细胞、上皮细胞和嗜酸性粒细胞。有研究证实RANTES的表达升高与气道炎症的严重程度关系密切[18]。在气道炎症过程中，RANTES在促进EOS从骨髓中释放的同时，局部RANTES还可招引EOS聚集于支气管气道组织中，激活炎症细胞，使炎症介质释放增加，形成EOS为主的效应细胞形成的气道炎性病变。本实验结果显示，HE染色镜下哮喘模型组大鼠肺组织病理改变及炎症程度明显，经“三穴五针法”针刺干预后，上述改变明显减轻。哮喘模型组大鼠肺组织Eotaxin、RANTES的表达水平显著高于正常对照组(P均<0.05)，针刺干预组大鼠肺组织Eotaxin、RANTES的表达水平较哮喘模型组明显降低(P均<0.05)。以上说明，“三穴五针法”能有效地降低哮喘模型大鼠肺组织中Eotaxin、RANTES的含量，减轻气道炎症反应，从而控制哮喘的发作。