坛紫菜多酚提取工艺及体外抗氧化与抑菌活性研究

陈洪彬 宋露露 金瑾萱 程永强

(1. 泉州师范学院海洋与食品学院，福建 泉州 362002；2. 福建省海洋藻类活性物质与功能开发重点实验室， 福建 泉州 362002；3. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

坛紫菜(Porphyrahaitanensis)又名紫菜、乌菜，是中国浙江、福建和广东沿海主要养殖的大型藻类[1]。根据2016年中国渔业统计分析，2015年中国养殖紫菜约1.16×105t，其中福建养殖约5.3×104t，占中国总产量近50%[2]，但每年用于鲜食或加工的均为前2～3次收割的紫菜，末水残次坛紫菜基本被废弃，占总量10%以上。坛紫菜富含膳食纤维和蛋白质，营养和药用价值极高，提取低值坛紫菜中的有效活性成分可以提高其附加值，减少资源浪费和环境污染，为紫菜深加工拓宽新渠道。

海藻多酚主要是海藻植物中的间苯三酚衍生物或其聚合物，具有抗氧化、抑菌、增强机体免疫等多种生理活性[3-4]。福建的紫菜资源丰富，有关紫菜有效活性成分的研究主要集中在多糖[5-7]、多肽[8-9]方面，有关多酚类的研究还处在起步阶段。Kazowska等[10]研究表明，紫菜多酚通过提高巨噬细胞中一氧化氮的含量来抵抗体外炎症的发生。李锋等[11]对坛紫菜多酚进行分离纯化，发现坛紫菜多酚除了具有较强的体外抗氧化能力，还可以抑制皮肤表皮的紫外线伤害。也有研究[12]发现，紫菜多酚提取物能显著抑制中国对虾冷藏过程中微生物的增殖作用，保持较好的冷藏对虾品质。李颖畅等[13]和钟明杰等[14]分别采用超声波和微波辅助提取紫菜多酚，可以较好地提高紫菜多酚的提取率。超声波辅助提取法因其机械效应和热效应，具有高提取率、低能量和可有效保护活性成分的生理作用等优势，在活性物质提取方面被广泛应用[13,15]。目前，有关超声波辅助提取坛紫菜多酚研究较少，对坛紫菜多酚的体外抗氧化活性评价以清除DPPH自由基和羟基自由基能力为主[11,14,16]，方式较为单一，而有关坛紫菜多酚的抑菌活性评价鲜见报道。本试验以福建养殖的坛紫菜为原料，利用超声波辅助提取坛紫菜多酚，在预试验的基础上，考察液料比、超声时间和乙醇浓度对坛紫菜多酚含量的影响，通过响应面法优化坛紫菜多酚的提取工艺参数；采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)来系统评价坛紫菜多酚体外抗氧化活性，采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和藤黄八叠球菌来系统评价其体外抑菌活性，为坛紫菜多酚的利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

坛紫菜：石狮古浮四水坛紫菜，烘干粉碎至80目，备用(含水量为4.58%±0.11%)；

多功能酶标仪：Infinite 200 PRO型，瑞士帝肯集团公司；

紫外可见分光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限责任公司；

分析天平：CP224C型，奥豪斯仪器上海有限公司;

万能粉碎机：ZN-02型，北京兴时利仪器有限公司；

高速冷冻离心机：GL-20G-II型，上海安亭科学仪器厂；

全自动菌落计数仪：SupcreG6R型，杭州迅数科技有限公司；

隔水式恒温培养箱：GHP-9050型，上海一恒科学仪器有限公司；

双频数控超声波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超声仪器有限公司；

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析纯，美国西格玛奥德里奇公司；

FL荧光素钠、AAPH、Trolox、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过硫酸钾等：分析纯，德国克雷贝尔公司；

没食子酸、福林酚、无水碳酸钠、无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 坛紫菜多酚提取工艺

坛紫菜→粉碎→过筛(80目)→超声辅助提取→离心(8 000 r/min，30 min)→坛紫菜多酚提取液

1.2.2 多酚含量的测定 参考陈洪彬等[15]的方法，以没食子酸计，用mg GAE/g表示(烘干后粉末重量)。

1.2.3 坛紫菜多酚体外抗氧化活性和抑菌活性的测定

(1) DPPH自由基清除率：参照文献[15]。

(2) ABTS自由基清除率：参照文献[17]。

(3) 氧自由基吸收能力：参照文献[18]。

(4)IC50值：参照文献[15]。

(5) 抑菌效果：采用打孔法评价，用自动菌落计数联用仪记录抑菌圈的直径。

1.2.4 单因素和响应面试验设计

(1) 液料比：在超声时间40 min、乙醇浓度60%的条件下，分别考察不同液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1(mL/g)] 对坛紫菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

(2) 超声时间：在液料比30∶1 (mL/g)、乙醇浓度60%的条件下，分别考察不同超声时间(10，20，30，40，50 min)对坛紫菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

(3) 乙醇浓度：在液料比30∶1 (mL/g)、超声时间40 min 的条件下，分别考察不同乙醇浓度(20%，40%，60%，80%，100%)对坛紫菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

(4) 响应面试验：在单因素试验的基础上，以液料比、超声时间、乙醇浓度为试验因素，以坛紫菜多酚含量为评价指标，设计三因素三水平响应面试验优化坛紫菜多酚超声波辅助法提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比 由图1可知，随着液料比的增加，坛紫菜多酚含量呈先升高后降低的趋势。在液料比为30∶1 (mL/g)时，坛紫菜多酚含量最高，为(6.80±0.04) mg GAE/g，之后坛紫菜多酚含量有所下降。这是因为液料比过低不利于坛紫菜多酚的溶出，而较高的液料比将溶出更多杂质，影响多酚的溶出，同时也增加后续浓缩成本。本研究多酚含量的变化趋势与李颖畅等[13]的研究结果类似。因此，选择液料比为30∶1 (mL/g)。

2.1.2 超声时间 由图2可知，随着超声时间的延长，坛紫

图1 液料比对坛紫菜多酚含量的影响

Figure 1 Effects of liquid-material ratio on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

菜多酚含量升高。在超声10～30 min时，坛紫菜多酚含量增加快速，之后缓慢升高，到超声40 min时，坛紫菜多酚含量达到最大值，之后趋于稳定。这是因为超声达到一定时间后，坛紫菜多酚已基本溶出，再延长超声时间，已经无法再有多酚溶出。该多酚含量的变化趋势与陈洪彬等[15]的类似。因此，选择超声时间为40 min。

图2 超声时间对坛紫菜多酚含量的影响

Figure 2 Effects of ultrasonic times on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

2.1.3 乙醇浓度 由图3可知，乙醇浓度对坛紫菜多酚含量的影响较大。随着乙醇浓度增加，坛紫菜多酚含量整体呈先升高后下降的趋势。乙醇浓度在20%～60%时，超声辅助提取的坛紫菜多酚含量快速升高，乙醇浓度在60%时，坛紫菜多酚含量达到最大值，为(6.81±0.06) mg GAE/g，之后坛紫菜多酚含量快速下降，当乙醇浓度达到100%时，坛紫菜仅有少量多酚被超声浸出。这可能是海藻中的多酚类物质以间苯三酚及其衍生物为主[3]，水溶性较高，过高的乙醇浓度不利于多酚物质的溶出。因此，选择乙醇浓度为60%。

2.2 响应面法优化设计

2.2.1 试验设计与结果分析 根据单因素试验结果，以坛紫菜多酚含量作为响应值。根据Box-Benhnken 中心组合原理进行响应面设计，试验因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

图3 乙醇浓度对坛紫菜多酚含量的影响

Figure 3 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

表1 因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 坛紫菜多酚提取响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design-Expert 8.05软件对响应面试验结果进行分析，得到以坛紫菜多酚含量(Y)为响应值的回归方程：

Y=6.71+0.26A+0.39B+0.51C+0.04AB-0.29AC-0.30BC-0.18A2-0.52B2-0.47C2。

(1)

对各项方差的进一步分析可知，3个因素对坛紫菜多酚含量的影响顺序为：乙醇浓度>超声时间>料液比。其中，B、C、B2和C2项对坛紫菜多酚含量的影响达到极显著水平，A、AC和BC项达到显著水平。在α=0.05显著水平下将不显著项进行剔除，得到优化后的回归方程：

Y=6.63+0.26A+0.39B+0.51C-0.29AC-0.30BC-0.53B2-0.48C2。

(2)表3 方差分析†Table 3 ANOVA of the constructed regression model

2.2.2 试验因素间的交互作用 对表3进一步分析，发现乙醇浓度与液料比、超声时间的交互项对坛紫菜多酚含量的影响达到显著水平(P<0.05)，其中乙醇浓度与超声时间之间对坛紫菜多酚含量的交互影响最大。为更直观说明交互影响作用，对交互项作响应曲面图和等高线图。由图4可以看出，乙醇浓度和超声时间之间的响应面曲面坡度陡峭，等高线图呈扁平椭圆状，说明乙醇浓度和超声时间之间具有较强的交互作用，对坛紫菜多酚含量的影响大。

2.2.3 最佳工艺参数 进一步分析响应面分析回归方程，得到坛紫菜多酚提取最优工艺参数为：液料比35.06∶1 (mL/g)、超声时间43.08 min、乙醇浓度65.86%，此时超声辅助提取坛紫菜多酚的理论含量为6.91 mg GAE/g。为检验响应面结果的可靠性，对最优工艺参数进行验证实验(n=3)，根据实际操作情况，将验证条件修正为液料比35∶1(mL/g)、超声时间43 min、乙醇浓度66%，此时提取的坛紫菜多酚含量为(6.85±0.13) mg GAE/g。

2.2.4 体外抗氧化和抑菌活性评价 根据响应面优化工艺结果，制备坛紫菜多酚，采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)评价该坛紫菜多酚的体外抗氧化活性，以抗坏血酸为阳性对照，结果见表4和图5。由表4可知，坛紫菜多酚具有一定的抗氧化活性，其多酚含量与DPPH自由基、ABTS自由基清除率呈线性正相关性。坛紫菜多酚的DPPH自由基清除率IC50值为(36.54±0.75) μg/mL，是阳性对照抗坏血酸的2.33倍，说明它的体外抗氧化效果低于同浓度下的抗坏血酸；坛紫菜多酚的ABTS自由基清除率IC50值为(16.07±0.32) μg/mL，略弱于同浓度下抗坏血酸的[抗坏血酸ABTS自由基IC50值为(11.96±0.26) μg/mL]。根据图5，按文献[17]的计算方法，得到坛紫菜多酚的氧自由基吸收能力值为(1 005.1±11.8) μmol TE/g，说明坛紫菜多酚具有较高的抗氧化能力。

图4 乙醇浓度和超声时间对坛紫菜多酚含量的交互影响Figure 4 Interaction effects of ethanol concentration and ultrasonic times on the contents of polyphenols from Porphyra haitanensis表4 坛紫菜多酚和抗坏血酸的DPPH自由基、ABTS自由基清除率IC50值Table 4 IC50 values for DPPH free radical, ABTS free radical of polyphenols from Porphyra haitanensis and ascorbic acid

评价指标评价对象回归方程R2IC50/(μg·mL-1)DPPH自由基坛紫菜多酚y=0.898 6 x+17.1090.990 636.54±0.75抗坏血酸 y=2.157 7 x+16.0730.995 215.71±0.18ABTS自由基坛紫菜多酚y=2.783 5 x+5.322 80.991 616.07±0.32抗坏血酸 y=3.604 6 x+6.933 40.996 311.96±0.26

图5 紫菜粗多酚和水溶性VE溶液荧光衰减曲线

Figure 5 The attenuation curve of fluorescence intensity ofPorphyrahaitanensispolyphenol and trolox

由表5可知，不同浓度的坛紫菜多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和藤黄八叠球菌的抑菌效果不同，随着坛紫菜多酚浓度的增加，其抑菌圈直径逐渐增大，对不同微生物的抑制效果也随之提高。进一步分析可知，坛紫菜多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和藤黄八叠球菌的最小抑菌浓度分别为1，1，1，2 mg/mL。因此认为，坛紫菜多酚具有一定抑菌活性。

3 结论

本研究利用超声波辅助提取四水坛紫菜中的多酚，以多酚含量为评价指标，通过单因素和响应面试验确定坛紫菜多酚最佳提取工艺条件为液料比35∶1 (mL/g)、超声时间43 min、乙醇浓度66%，在此条件下，坛紫菜多酚含量为(6.85±0.13) mg GAE/g，与钟明杰等[14]采用微波辅助提取的紫菜多酚相比含量要高，可能是微波辐射破坏多酚的结构。同时，本研究结果与李颖畅等[13]采用超声波辅助提取的紫菜多酚含量基本一致，说明利用超声波辅助提取紫菜多酚的方法可靠，为低值坛紫菜制备多酚的工业化生产提供技术参数。通过体外抗氧化和抑菌试验，发现坛紫菜多酚具有较强的抗氧化活性和抑菌活性，是一种潜在的天然抗氧化和抑菌物质，但有关它的抗氧化、抑菌活性及其他生物活性和构效关系有待进一步深入研究。

表5 不同浓度坛紫菜多酚的体外抑菌效果†Table 5 Bacteriostasis effects of different concentrations of polyphenols from Porphyra haitanensis in vitro

† 牛津杯内径6 mm，外径8 mm。