6种葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸含量测定及比较

卫阳飞 宋 海 岳国仁 张宏曦 李彩霞，3

(1. 河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000；2. 甘州区食品药品监督管理局， 甘肃 张掖 734000；3. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000)

葡萄籽是葡萄酒生产过程中的副产物。随着中国葡萄酒行业的发展，每年产生的葡萄籽下脚料达数万吨[1]。研究表明，葡萄籽含有丰富的蛋白质、葡萄籽油、原花青素和多种维生素[2]，除了具有一定的营养价值，还具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗辐射[5]、保护心肌[6]等药理活性。因此，近年来如何就葡萄籽这种资源性副产物进行开发利用引起了广泛关注。目前有关葡萄籽油和原花青素的研究较为常见，而葡萄籽蛋白质虽营养和生物活性价值已为人们所认识，但对其化学组成研究却相对较少，缺乏相应的质量控制指标。

氨基酸是组成蛋白质的基本单位，在葡萄籽内以结合态和游离态2种形式存在。由于大多数氨基酸的极性强、挥发性低、无强发色基团，造成其分离和检测比较困难[7]。目前常用的检测方法为氨基酸分析仪[8-9]和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[10-11]。前者操作简单、分析速度快、灵敏度高，而HPLC因其仪器较为常见、衍生试剂多样等特点，近年来亦得到广泛应用。现有文献[12-14]多采用氨基酸分析仪对葡萄籽蛋白质中水解氨基酸的含量进行测定，而采用HPLC同时分析葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸组成的研究还未见报道。

故为了更好地利用葡萄籽资源，充分实现资源的循环再利用，本研究拟以6种常见酿酒葡萄籽为原料，采用衍生化高效液相色谱法对其所含水解氨基酸和游离氨基酸成分进行分析，为葡萄籽的开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

葡萄籽：黑皮诺、雷司令购自甘肃皇台酒业股份有限公司(武威)，蛇龙珠、赛美容购自甘肃祁连葡萄酒有限责任公司(兰州)，赤霞珠、贵人香购自甘肃紫轩酒业有限公司(嘉峪关)，其中黑皮诺、蛇龙珠和赤霞珠为红葡萄酒酿酒品种(红籽)，而雷司令、赛美容和贵人香为白葡萄酒酿酒品种(白籽)，粉碎后过60目筛备用；

17种氨基酸混合对照溶液：包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸，浓度均为2.5 μmol/mL，日本和光纯药工业有限公司；

17种氨基酸的单体对照品：中国食品药品检定研究院；

异硫氰酸苯酯：纯度≥98%，阿拉丁试剂有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，天津市兴复精细化工研究所；

超纯水：自制。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Agilent 1260型，美国安捷伦公司；

超声波清洗仪：KQ250B型，昆山市超声仪器有限公司；

电子分析天平：AUW120D型，日本岛津公司；

旋转蒸发仪：RE-2000A型，上海亚荣生化仪器厂；

超纯水仪：Nex Power 1000型，韩国HUMAN公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的制备

(1) 水解氨基酸样品溶液：取不同葡萄籽样品0.1 g，精密称定，置于水解管中，加入6.0 mol/mL盐酸15 mL，密封后于110 ℃水解24 h，抽滤，取滤液于旋转蒸发仪中浓缩挥发去盐酸，用0.02 mol/L盐酸定容至100 mL。以不加样品的溶液为空白对照。

(2) 游离氨基酸样品溶液：取不同葡萄籽样品1.0 g，精密称定，加入20 mL水，浸泡2 h，60 ℃、250 W超声提取1 h，抽滤，取滤液冷冻干燥成粉，加水定容至10 mL备用。以不加样品的溶液为空白对照。

(3) 混合对照溶液：将浓度为2.5 μmol/mL的氨基酸混合对照溶液用0.02 mol/L盐酸依次稀释，制备成各氨基酸浓度均为1.250 0，0.625 0，0.125 0，0.062 5，0.012 5 μmol/mL的系列标准溶液。

1.2.2 衍生化方法的优化 取混合对照溶液和供试品溶液各200 μL，分别加入0.1 mol/mL异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1.0 mol/mL三乙胺乙腈溶液100 μL，混匀，室温反应一定时间(0.5，1.0，1.5 h)，再分别加入正己烷400 μL，剧烈振摇以除去多余的衍生试剂及副产物，重复此步骤(1，2，3次)，合并下层溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。考察衍生反应时间和正己烷加入次数对氨基酸测定结果的影响。

1.2.3 高效液相色谱条件的优化 Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相A：称取15.2 g无水乙酸钠，加水1 850 mL，溶解后用冰醋酸调pH(5.5，6.0，6.5，7.0)，再加乙腈140 mL，混匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤；流动相B：甲醇-乙腈-水(体积比20∶60∶20)，梯度洗脱(0～5 min，100% A～98% A；5～6 min，98% A～95% A；6～14 min，95% A～91% A；14～18 min，91% A～79% A；18～32 min，79% A～55% A；32～34 min，55% A～45% A；34～38 min，45% A～0% A；38～42 min，0% A～0% A；42～45 min，0% A～100% A；45～50 min，100% A～100% A)；流速为1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。考察色谱流动相缓冲液pH对分离效果的影响。

1.2.4 方法学验证

(1) 专属性考察：在“1.2.3”优化好的色谱条件下进样分析水解氨基酸和游离氨基酸样品溶液(均以雷司令为例)、空白溶液和17种氨基酸的混合对照品溶液的衍生化产物。

(2) 线性关系考察：分别精密吸取衍生化后的不同浓度混标溶液10 μL，按“1.2.3”优化好的色谱条件测定不同浓度下各氨基酸的峰面积，以摩尔浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。

(3) 重复性考察：按照“1.2.1”和“1.2.2”项下优化后的方法，制备5份雷司令水解氨基酸和5份游离氨基酸供试品溶液，按“1.2.3”项下优化后色谱条件测定，分别计算不同样品中氨基酸峰面积的RSD。

(4) 稳定性考察：分别取制备好的同一份雷司令水解氨基酸和游离氨基酸供试品溶液，按“1.2.3”项下优化后色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24 h进行测定，计算不同时间测定氨基酸峰面积的RSD。

(5) 加标回收试验：取5份已知含量的同一份雷司令样品0.1 g，精密称定，分别加入浓度为2.5 μmol/mL的氨基酸混合对照品溶液1.0 mL；取5份已知含量的同一份雷司令样品1.0 g，精密称定，分别加入浓度为2.5 μmol/mL的氨基酸混合对照品溶液0.5 mL；均按照“1.2.1”和“1.2.2”项下优化后方法制备供试液，按照“1.2.3”项下优化后色谱条件进行分析，根据测得量与加入量计算各水解氨基酸和游离氨基酸的回收率及RSD。

2 结果与分析

2.1 衍生化及色谱条件的优化

目前氨基酸的柱前衍生检测常用的衍生试剂包括邻苯二甲醛(O-Phthaldiadehyde，OPA)、异硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate，PITC)、丹磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtha-lene-5-sulphonylchloride，Dansyl-Cl)等，其中PITC能够与一级和二级氨基酸同时反应生成苯氨基硫甲酰衍生物，具有衍生反应速度快[15]，灵敏度较高，衍生产物单一、稳定等优点，故本研究采用PITC作为氨基酸的柱前衍生试剂。如图1、2所示，当衍生反应时间超过1.0 h时，HPLC检测氨基酸峰面积无明显增加，而正己烷加入2次后再增加次数色谱图中衍生物试剂杂峰未见减少。故最终选择衍生化反应时间为1.0 h，正己烷加入次数为2次。该结果与郭俊国等[16]关于氨基酸衍生化反应时间的优化结论吻合。

如图3所示，结果发现氨基酸的测定受pH影响较大，保持其他条件不变，只有当pH为6.5时才可实现17种氨基酸的分离。pH会直接影响氨基酸衍生物的保留时间和峰形[17]，导致分离困难，推测可能与pH会影响氨基酸与PITC反应生成的苯氨基硫甲酰衍生物存在形式及其与色谱柱之间相互作用有关。

图1 衍生反应时间对氨基酸衍生物测定的影响

Figure 1 Effect of the reaction time on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

图2 正己烷加入次数对氨基酸衍生物测定的影响

Figure 2 Effect of n-hexane addition times on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

图3 pH对氨基酸衍生物测定的影响Figure 3 Effect of pH on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

2.2 方法的专属性和线性关系考察

由图4可知，17种氨基酸在37 min内达到完全分离，内源性物质和衍生化试剂不干扰氨基酸的测定。线性考察结果见表1，相关系数R2为0.999 0～0.999 8。该结果与黄蕴芝等[18]将氨基酸经阳离子交换树脂富集后，采用Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-水(体积比4∶1)为流动相A，30 mmol/L乙酸钠-乙腈(体积比355∶15)为流动相B的色谱条件取得的分离效果近似。王菲菲等[19]选用Waters ACQUITY UPLC H-Class-PDA超高效液相色谱系统以及AccQ-TagTMUltra(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱，在衍生化试剂相同情况下，将色谱分析时间缩短至10 min，提高了分析效率，值得在以后的研究中借鉴。

2.3 重复性、稳定性和加标回收试验

结果表明，同法处理的5份样品中不同水解氨基酸峰面积的RSD为0.67%～3.15%，不同游离氨基酸峰面积的RSD为0.93%～4.43%，表明该方法的重复性良好。同一个样品不同时间测定的水解氨基酸峰面积的RSD为0.54%～2.44%，游离氨基酸峰面积的RSD为0.76%～3.45%，表明该法处理所得供试品溶液在24 h内保持稳定。加标回收试验结果见表2，水解氨基酸的平均回收率为92.0%～104.6%，RSD为0.83%～4.07%，游离氨基酸的平均回收率为95.2%～102.4%，RSD为1.06%～3.98%。水解氨基酸的平均回收率范围略大于游离氨基酸的，可能与水解氨基酸的酸水解步骤相关。

1. 天冬氨酸 2. 谷氨酸 3. 丝氨酸 4. 甘氨酸 5. 组氨酸 6. 精氨酸 7. 苏氨酸 8. 丙氨酸 9. 脯氨酸 10. 酪氨酸 11. 缬氨酸 12. 甲硫氨酸 13. 赖氨酸 14. 异亮氨酸 15. 亮氨酸 16. 苯丙氨酸 17. 胱氨酸 A. 雷司令游离氨基酸样品 B. 雷司令水解氨基酸样品 C. 空白对照 D. 17种氨基酸混合对照品

图4 各样品色谱图 Figure 4 HPLC chromatograms of different samples表1 不同氨基酸的线性方程、检测限和定量限Table 1 Linear regression, LODs and LOQs of different references

表2 加标回收试验结果Table 2 Results of recovery tests (n=5) %

2.4 样品测定结果与分析

取衍生好的不同葡萄籽样品溶液，按照“1.2.3”优化后色谱条件进行测定，结果见表3和图5。结果表明，不同品种葡萄籽中水解氨基酸均以谷氨酸、脯氨酸为主，其次是甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸和亮氨酸。游离氨基酸以精氨酸、脯氨酸和谷氨酸为主。6种葡萄籽中水解氨基酸的总含量为130.46～163.24 mg/g，游离氨基酸的总含量为2.04～5.13 mg/g，白籽中游离氨基酸含量普遍高于红籽，而红籽中水解氨基酸含量普遍高于白籽。

不同葡萄籽水解氨基酸样品中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的22.37%～25.16%，必需氨基酸/非必需氨基酸为33.09%～38.41%，红籽和白籽差别不大。而游离氨基酸样品中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的9.28%～39.95%，必需氨基酸/非必需氨基酸为15.31%～92.12%，白籽所含游离氨基酸中必需氨基酸比例明显高于红籽。

FAO/WHO提出的理想蛋白质的标准为：人体必需氨基酸含量/氨基酸总含量在40%左右，人体必需氨基酸含量/非必需氨基酸含量在60%左右[20]。从这一角度分析，葡萄籽蛋白质具有一定的蛋白补充功能。

2.5 葡萄籽中人体必须氨基酸比例与FAO/WHO理想氨基酸构成模式的比较

如表4所示，不同葡萄籽中苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸基本符合FAO/WHO理想氨基酸构成比例。

† *为必须氨基酸；**为儿童成长必须氨基酸。

表4 不同葡萄籽中必须氨基酸模式比例比较表Table 4 The comparativeTable of pattern scales of hydrolyzed amino acids in different grape seeds %

图5 不同葡萄籽中各氨基酸含量分布图Figure 5 The content distribution of amino acids in different grape seeds

3 结论

本研究建立了柱前衍生结合高效液相色谱测定葡萄籽中17种水解氨基酸和游离氨基酸含量的方法，该方法稳定，重复性好，结果可靠。葡萄籽中氨基酸含量丰富，6种葡萄籽中水解氨基酸的总含量为130.46～163.24 mg/g，游离氨基酸的总含量为2.04～5.13 mg/g。不同葡萄籽水解氨基酸样品中必需氨基酸含量占氨基酸总量的22.37%～25.16%，必需氨基酸/非必需氨基酸为33.09%～38.41%，苏氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸基本符合FAO/WHO理想氨基酸构成比例，表明葡萄籽蛋白质具有一定的蛋白补充功能。白籽中所含游离氨基酸含量普遍高于红籽，而红籽中水解氨基酸含量普遍高于白籽，推测从氨基酸角度出发，如果葡萄籽食用方法为打粉服食应选择红籽，而如果泡水饮用最好选择白籽类产品。本试验只选择了17种氨基酸作为研究对象，但在实际测定葡萄籽中水解和游离氨基酸的过程中，发现还有一些其他的氨基酸成分未得到检测，需要后续进行HPLC-MS鉴定或更多的标准品比对才能够得以证实。