牡丹提取物及乳酸菌替代低温火腿肠中亚硝酸盐的研究

袁 玲 诸葛斌 于司达 宗 红 陆信曜

(1. 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学工业生物技术教育部 重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江南大学生物工程学院工业微生物研究中心，江苏 无锡 214122)

低温肉制品因其最大限度地保留了原料肉的风味物质、营养成分及其良好的口感而受到青睐，是未来熟食肉制品发展的方向。亚硝酸盐长期以来作为发色剂应用于肉制品，其优点是可使肉制品呈现鲜艳的亮红色，抑制脂质氧化，还具有抑制肉毒杆菌及增强风味的作用，但亚硝酸盐可以和仲胺类物质反应生成强致癌物亚硝胺[1-2]，对人体健康产生威胁，因此替代肉制品中亚硝酸盐一直是人们研究的热点。

天然提取物来源安全，且大部分具有重要的生理功能[3]，已被用于食品、化妆品以及药品等领域，近年来利用天然提取物替代亚硝酸盐在肉制品中的发色和抗氧化作用的研究亦有进展。Riazi等[4]研究发现在牛肉火腿肠中添加1%的红葡萄果渣可以替代牛肉肠中60%的亚硝酸钠使用量，黄度值(b*)和亮度值(L*)降低，而抗氧化作用不受影响；Sabrine等[5]使用墨角藻黄素将香肠中亚硝酸钠使用量由150 mg/kg降至80 mg/kg，且抗氧化效果、火腿肠红度值与使用150 mg/kg亚硝酸钠的效果相近。

牡丹提取物是由干燥的牡丹花苞采用乙醇提取法制备而成，含有芍药素-3,5-O-二葡萄糖苷、天竺葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷等多种花色苷类天然色素，具有很强的抗氧化性[6]，但其在肉制品中的应用研究尚未有报道，另外，乳酸菌是当今国际公认的食品安全级微生物，在发酵过程中能大量产生乳酸、酒石酸和柠檬酸等有机酸，这些有机酸除具有天然防腐抑菌作用外，还能赋予食品柔和的酸味和香气，具有改善食品风味、增强营养等功能[7-8]。因此，本研究拟利用牡丹提取物及乳酸菌发酵液代替低温肉制品中的部分亚硝酸盐，考察其对火腿肠颜色、质构、脂质氧化程度、微生物菌落总数和风味的影响，为实现低硝低温肉制品的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

猪瘦肉、肥肉、盐、蔗糖、复合磷酸盐、味精、五香粉、料酒：购自无锡市欧尚超市；

小麦淀粉、大豆分离蛋白：江苏全盈生物科技公司；

Nisin：效价2×106IU/mg，兰州伟日生物工程有限公司；

牡丹花苞：洛阳红，河南洛阳；

葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、乙醇、2-硫代巴比妥酸、K2HPO4·H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、EDTA、三氯乙酸等试剂：国产分析纯；

牡丹提取物：采用乙醇提取法[乙醇体积分数为95%、温度为70～80 ℃、料液比1∶10(g/mL)的条件下回流提取2 h]从干燥的洛阳红牡丹花苞中提取并冷冻干燥成冻干粉。

1.1.2 菌株及培养基

短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)：由本研究室分离获得并保存；

MRS培养基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、乙酸钠5.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵1.45 g、吐温80 1.0 g、K2HPO4·H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、去离子水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.1.3 仪器

蒸汽灭菌锅：YXQ-LS-50S11型，上海博迅实业有限公司；

电热恒温培养箱：GNP-9080型，上海精宏实验设备有限公司；

高速冷冻离心机：Thermos-21R型，上海沪粤明科学仪器有限公司；

ISQ单四级杆气质联用仪：Trace1310-ISQ LT型，美国赛默飞世尔科技公司；

物性分析仪：TA.XT Plus型，英国SMS公司；

高精度分光测色仪：UltraScan Pro1166型，美国Hunterlab公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌发酵液制备 将Lactobacillusbrevis活化后以2%的接种量接种于100 mL的MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h后将发酵液(pH为4.3±0.1)于4 ℃、8 000 r/min离心3 min，收集上清后4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 低温火腿肠配方及制作流程

(1) 配方：猪瘦肉38%、肥肉17%、淀粉10%、大豆分离蛋白4%、盐1.8%、冰水25%、蔗糖0.7%、复合磷酸盐0.04%、味精0.6%、五香粉0.14%、料酒2.5%(按火腿肠总重计)。

(2) 工艺流程：

绞肉→腌制(加入盐、蔗糖、味精和料酒等调料，4 ℃腌制2 h)→搅拌(加入淀粉、冰水和大豆分离蛋白)→灌肠→蒸煮(90 ℃，30 min)→冷却至肠心温度低于20 ℃

1.2.3 试验设计 本研究共设置5个处理组，包括空白对照(不添加乳酸菌发酵液、牡丹提取物和亚硝酸钠)、阳性对照组(添加150 mg/kg亚硝酸钠)和3个试验组(以0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液分别替代阳性对照组1/3、1/2和2/3的亚硝酸钠用量)；另外在测定火腿肠菌落总数时添加500 mg/kg Nisin试验组作为对比。火腿肠制备完成后，置于37 ℃条件下储藏21 d(经阿伦尼乌斯方程Arrhenius equation换算此储藏条件相当于4 ℃条件下的194 d)备用检测。

1.2.4 火腿肠颜色的测定 将火腿肠切成约1 cm高的圆柱体，采用高精度分光测色仪测定火腿肠截面红度值(a*)，每组重复6次。

1.2.5 火腿肠质构的测定 参照文献[9]。

1.2.6 火腿肠中菌落总数的测定 参照GB 4789.2—2016《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》的方法。

1.2.7 硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的测定 参照文献[10]。

1.2.8 固相微萃取气质联用技术(SPME-GC-MS)测定火腿肠挥发性风味物质

(1) 顶空固相萃取条件：在15 mL的顶空瓶中装入3 g切碎的样品，在60 ℃下顶空吸收40 min，250 ℃下解吸2 min。

(2) 色谱条件：色谱柱为TG-5石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气(He)流速3.5 mL/min；进样品和接口温度250 ℃；升温程序：60 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持7 min；不分流进样。

(3) 质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70 eV；发射电流200 μA；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；激活电压350 V；质量扫描范围m/z33～450[11]。

1.2.9 感官评定 由具有感官评定经验的10位人员组成评定小组，其中5位女性、5位男性。采用盲评计分方式及排序法对火腿肠的感官指标进行评价。每个评定成员单独进行，相互不接触交流，样品评定之前用清水漱口。感官评价内容见表1，计分标准为10分制，并使用Excel软件将评分制成雷达图。

表1 感官评定内容Table 1 Contents of sensory evaluation of sausages

1.3 数据处理

根据气相质谱所得的谱图，结合保留指数和数据库检索对样品中挥发性成分进行定性分析，通过面积归一化法求得各化学成分在该样品挥发性风味物质中的相对含量；试验数据均使用Excel、SPSS 22统计软件，通过单因素方差(one-way ANOVA)、Fisher LSD分析均值间差异，以P<0.05判断差异显著性。

2 结果与讨论

2.1 牡丹提取物及乳酸菌发酵液对低温火腿肠红度值(a*)及质构的影响

红度值(a*)是描述肉制品颜色特征的重要参数[12]，为研究牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代部分亚硝酸钠对火腿肠颜色的影响，利用测色仪对火腿肠a*值进行测定，结果如图1所示。牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代亚硝酸钠火腿肠的a*值均显著高于空白对照(P<0.05)，替代1/3、1/2亚硝酸钠火腿肠的a*值显著高于阳性对照，替代2/3亚硝酸钠火腿肠的a*值与阳性对照相近，这是由于有色物质的添加，会改变火腿肠的颜色状态[13]，牡丹提取物中富含多种花色苷类天然色素[14]，对火腿肠红度有一定促进作用。在储藏过程中，由于火腿肠中脂肪及肌红蛋白等物质的氧化，除了空白对照，其它处理组的a*值均有所降低(差值<2)，与Riazi等[15]使用红葡萄果渣替代亚硝酸钠的研究结果相似。但Savadkoohi等[16]发现当颜色测定参数差值>2时才会引起视觉上的显著差异，因此，牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代亚硝酸钠火腿肠和阳性对照的a*值降低并不会引起感官评定上颜色的显著差异。储藏后期，各处理组火腿肠a*值趋于稳定，牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代2/3亚硝酸钠火腿肠a*值与阳性对照相近。

质构是评价火腿肠品质的一个重要指标，由表2可知，以牡丹提取物及乳酸菌发酵液替代不同量的亚硝酸钠，火腿肠的硬度、弹性、胶黏性、咀嚼度和恢复性均无显著变化(P<0.05)。因此，以牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代2/3用量的亚硝酸钠，可使火腿肠颜色达到150 mg/kg亚硝酸钠的发色效果且不改变火腿肠良好的质构特性。

不同小写字母表示同一贮藏时间不同样品之间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示同一样品不同贮藏时间之间差异显著(P<0.05)

图1 不同火腿肠颜色的变化

Figure 1 Colorparameters of different emulsion sausages

2.2 牡丹提取物及乳酸菌发酵液对低温火腿肠脂质氧化的影响

为考察火腿肠脂质氧化情况，在储藏期间对硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量进行测定，TBARS值越小，脂质氧化形成的丙二醛量越少，说明样品的脂质氧化程度越低。如图2所示，随着储藏时间的延长，各组火腿肠TBARS值不断升高，空白对照组上升最快，替代1/3、1/2和2/3亚硝酸钠火腿肠增长速度相对缓慢。与空白对照相比，添加了牡丹提取物及乳酸菌发酵液的火腿肠TBARS值均显著降低(P<0.05)，其中，替代1/3和1/2亚硝酸钠火腿肠的TBARS值显著低于阳性对照，替代2/3亚硝酸钠火腿肠的TBARS值与阳性对照相近，这是由于牡丹提取物中含有大量的花青素和没食子酸等多酚物质，活性酚羟基能够释放氢离子，从而破坏氧化链式反应，降低脂肪氧化水平[6,17]。李玉邯等[18]在腊肉中添加鼠尾草提取物(富含多酚类物质)，也可有效降低腊肉的TBARS值，抑制其脂肪氧化。为使亚硝酸钠添加量降到最低，此处选择替代低温火腿肠中2/3亚硝酸钠用量。

表2 不同火腿肠的质构特性Table 2 Texture characteristics of different emulsion sausages

图2 不同火腿肠TBARS值的变化Figure 2 Variation of TBARS values of different emulsion sausages

综上，牡丹提取物和乳酸菌发酵液在低温火腿肠中具有与亚硝酸盐相当的发色和抗氧化作用，可选择替代2/3亚硝酸钠使用量，使亚硝酸钠添加量由150 mg/kg降至50 mg/kg。

2.3 牡丹提取物及乳酸菌发酵液在火腿肠中的抑菌作用

为研究添加牡丹提取物和乳酸菌发酵液替代2/3亚硝酸钠对火腿肠的抑菌效果，以目前火腿肠中普遍使用的生物防腐剂Nisin为对照，添加量选取Nisin国家标准规定的最大限量500 mg/kg，对火腿肠中的菌落总数进行测定，结果如图3所示。在37 ℃储藏条件下，复配火腿肠(替代2/3亚硝酸钠火腿肠)菌落总数显著低于空白对照和阳性对照(P<0.05)；随着储存时间的延长，空白对照和阳性对照菌落总数上升趋势比较明显，复配火腿肠在前9 d菌落总数与添加500 mg/kg Nisin火腿肠相同，第9天后细菌菌落总数开始逐渐增加，略高于添加500 mg/kg Nisin的火腿肠。据GB/T 20712—2006规定，火腿肠内菌落总数超过50 000 CFU/g(lg 50 000=4.70)，即认为是已经腐败不能食用。37 ℃条件下复配火腿肠在第15天(相当于4 ℃条件下138 d)时达到腐败水平，这主要是由于乳酸菌发酵液中的有机酸和细菌素等抑菌性物质对火腿肠中的腐败菌产生较强的抑制作用[19-20]。另外，本实验室前期研究[21]表明牡丹提取物对大肠杆菌、金黄葡萄球菌和假单胞菌等腐败菌有较强的抑菌作用，且热稳定性较好，即使在90 ℃条件下处理30 min抑菌活性亦不受影响。因此，牡丹提取物的添加也具有一定的抑菌作用。

复配火腿肠指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液替代阳性对照2/3亚硝酸钠使用量的火腿肠

图3 不同火腿肠菌落总数的变化

Figure 3 Variation of total bacterial count of different emulsion sausages

2.4 牡丹提取物及乳酸菌发酵液对火腿肠风味物质的影响

采用SPME-GC-MS对火腿肠挥发性成分进行分析，在3组火腿肠中均检测出232种挥发性化合物，其中对火腿肠风味贡献较大的化合物及其相对含量如表3所示。与空白对照相比，添加牡丹提取物及乳酸菌发酵液替代2/3亚硝酸钠的复配火腿肠中醛类和酮类物质相对含量降低，酸类和酯类等风味物质相对含量升高。添加牡丹提取物和乳酸菌发酵液后，火腿肠中己醛、戊醛和2,5-辛烷二酮的相对含量下降较为明显，其中己醛相对含量为6.58%，显著低于阳性对照(9.38%)，大部分醛类和酮类是脂质氧化的产物，这与试验组TBARS值较低的结果一致。复配火腿肠中酸类物质(如乙酸和辛酸等)含量增加，可能是加入乳酸菌发酵液中含有大量的乳酸和乙酸等有机酸，这些有机酸为火腿肠风味的改善起到一定的作用[22]。酯类物质中，复配火腿肠的己酸乙酯相对含量为3.05%，高于空白对照和阳性对照组的1.14% 和2.59%，己酸乙酯具有强烈的曲香香气和令人愉快的苹果、菠萝和香蕉样的果香，是腊肠的主体风味物质之一[23]。另外，复配火腿肠中2-戊基呋喃和麦芽酚相对含量分别为1.72%和0.44%，均高于空白对照组，2-戊基呋喃具有豆香、果香及类似蔬菜的香韵，是肉类特征香料；麦芽酚具有焦奶油硬糖的特殊香气，稀溶液具有草莓样芳香味道[24]，这些挥发性香味物质促进了复配火腿肠良好风味的形成。

表3 火腿肠挥发性风味物质的种类及相对含量†Table 3 The variety and relative content of volatile flavor in emulsion sausages %

† 复配火腿肠指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液替代阳性对照2/3亚硝酸钠使用量的火腿肠；“nd”表示未检测到；同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 感官评定

如图4所示，添加牡丹提取物及乳酸菌发酵液替代2/3亚硝酸钠的复配火腿肠色泽评分显著高于空白对照组(P<0.05)，与阳性对照相近，呈现出与添加150 mg/kg亚硝酸钠相似的肉红色且色泽均匀，火腿肠的质地、弹性和口感无明显改变，与质构测定结果一致；复配火腿肠风味评分高于空白对照，牡丹提取物和乳酸菌发酵液的添加使火腿肠具有独特的香味，清爽无油腻感，与阳性对照比较接近。因此，利用0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液替代低温火腿肠中2/3亚硝酸钠用量感官评定总体接受性良好。

复配火腿肠指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液替代阳性对照2/3亚硝酸钠使用量的火腿肠

图4 不同火腿肠感官评定得分的雷达图

Figure 4 Radar chart of sensory evaluation of different emulsion sausages

3 结论

本试验研究了低温火腿肠中添加牡丹提取物及乳酸菌发酵液替代部分亚硝酸盐的效果。研究表明，在火腿肠中添加0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液，使火腿肠亚硝酸钠添加量由150 mg/kg降至50 mg/kg，火腿肠颜色与抗氧化效果不受影响。此外，添加牡丹提取物和乳酸菌发酵液可使火腿肠菌落总数显著降低(P<0.05)，具有一定的抑菌防腐作用；挥发性风味物质中醛类和酮类相对含量下降，酸类和酯类等风味物质相对含量明显升高，对改善火腿肠风味有一定的贡献。以上研究结果表明，牡丹提取物和乳酸菌发酵液可替代亚硝酸钠在低温火腿肠中的发色和抗氧化功能，同时具有一定的抑菌和增强风味作用，为提高火腿肠品质和安全性提供一种新方法，但对于牡丹提取物和乳酸菌发酵液中活性成分的构效关系及其作用机制需进一步深入研究。