水稻超亲变异系和品种间OsRSR1 基因序列比较及其性状变异机制分析

王海微，韩云飞，朱 琳，曲 悦，何沈雨，张忠臣，金正勋

(东北农业大学 农学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

淀粉是水稻胚乳的主要成分，由直链淀粉和支链淀粉组成，2种淀粉的比例及支链淀粉的精细结构等决定稻米产量和蒸煮食味品质。在水稻胚乳中淀粉合成与积累过程非常复杂，涉及一系列的酶促反应，其中，ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶是起主要作用的关键酶[1]，其酶基因的表达量及酶活性大小对淀粉合成积累和淀粉品质影响都很大。基因的表达量和酶活性以及酶活性与淀粉合成积累和结构等都有密切关系。基因的表达受转录因子、启动子等调控基因的控制，是真核生物在转录水平上调节基因表达的重要途径[2]。转录因子是一种DNA结合蛋白，通过与目的基因启动子区顺式作用元件(cis-acting factor)发生相互作用，激活或抑制结构基因的转录。如WRKY家族转录因子基因SUSIBA2在大麦胚乳灌浆过程中特异性激活异淀粉酶基因ios1和淀粉分支酶基因sbeⅡb的转录表达，能够促进大麦淀粉的合成[3]；利用反义寡核苷酸技术抑制SUSIBA2基因的活性后isol和sbeⅡb基因的表达量降低，从而影响淀粉的合成[4]。自1987年玉米转录因子被首次报道后[5]，数百种参与调控植物生长发育以及各种代谢、激素应答、抗病、干旱、高盐、低温等相关的转录因子相继被分离出来[2]，其中，MYB、AP2/EREBP、bHLH、Zinc finger、HB、PHD、NAC以及WRKY等是植物基因组中的主要类型[6]。OsRSR1(Rice starch regulator1)基因编码的蛋白是水稻众多转录因子中的一个，是属于AP2/EREBP转录因子家族成员，参与淀粉合成调控，OsRSR1基因的过表达使种子中的淀粉合成基因下调表达，OSRSR1的缺乏会导致种子中淀粉合成关键酶基因表达量增加[7]。在小麦胚乳灌浆过程中，TaRSR1基因的转录表达量与淀粉合成酶基因TaAGPS1-a、TaAGPL1、TaGBSSI、TaSSI、TaSSIIa、TaSSIV、TaBEI、TaBEIIb、TaPUL、TaPHOL、TaDPE1表达量呈负相关[8]。另一方面，储藏于DNA碱基序列中的生物遗传信息是通过mRNA的转录和蛋白质的翻译最终表达，其中基因表达量的多少对表观性状影响很大[9]。而且，在基因编码区中一个碱基的变化会改变对应蛋白的功能，植物调节基因上如发生等位变异，则可能影响整个基因在植物中的表达水平，最终导致定量突变，而二者都是表型变异的驱动者和种质差异的决定因素[10]。作物品种间有性杂交后代产生超亲变异是普遍的遗传变异现象，也是选育作物新品种的重要变异来源，而且品种间有性杂交仍然是目前或将来选育新品种的主要途径。因此，研究不同类型水稻品种及有性杂交后代转录因子基因的表达特点及基因碱基序列分析，对深入了解性状遗传变异的分子机理具有重要的理论意义。

本研究选用籽粒直链淀粉含量很高的籼稻品种和极低的糯稻品种及遗传背景相似，但籽粒直链淀粉含量存在显著差异的粳稻亲本和杂交子代超亲变异系等为供试材料，比较分析OsRSR1表达特点及序列和功能变异，旨在深入了解OsRSR1序列变异特点和表达特点及其与性状遗传变异关系，进而为解析基因转录水平的分子调控和遗传变异机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用胚乳直链淀粉含量有显著差异的粳稻品种系选1号和通769及该品种做亲本配制选育的子代超亲变异系东农1701和东农1724以及直链淀粉含量极高的籼稻品种八十儿和极低的糯稻品种龙稻8号，于2016年和2017年在东北农业大学农学院内进行盆栽试验，盆规格为长100 cm、宽40 cm、高40 cm。为使供试材料抽穗期保持一致，于4月15日按各材料的生育期进行分期播种，单粒等距离点播催芽籽，大棚钵体盘育苗，旱育秧管理。5月15-20日选长势一致且生长良好的秧苗等距离插秧，每个品种插2盆，每盆插8穴，每穴插1棵，正常水肥管理。

供试材料抽穗时，选取长势一致且穗部抽出叶鞘3 cm的稻穗挂牌标记，分别于标记后的10，20，30，40 d取样，选取穗中部灌浆一致的30个籽粒，在低温下去壳去胚放入冻存管中，-80 ℃超低温保存，用于淀粉含量测定和荧光PCR定量及基因克隆。

1.2 试验试剂

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α和载体QBV-3由中国科学院东北地理与农业生态研究所卜庆云研究员惠赠。DNA Marker、克隆试剂盒购自Vazyme公司，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、EcoR V限制性核酸内切酶购自TaKaRa公司，EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit质粒提取纯化试剂盒购自Transgen公司。cDNA合成试剂盒All-in One First-Strand Synthesis MasterMix(with DNase 1)、TaqSYBR®Green qPCRPreMix试剂盒、氯霉素(Cam)购自NOVA江苏连云港愚公生物有限公司。PCR 片段回收试剂盒购自Thermo公司。其他各种生化试剂均为国产分析纯。

1.3 OsRSR1表达量测定

采用qRT-PCR方法测定籽粒OsRSR1表达量。取-80 ℃冰箱中保存的籽粒约0.2 g，用TRIzol法提取总RNA，用All-in One First-Strand Synthesis MasterMix(with DNase 1)试剂盒进行cDNA的合成。使用Premier 5.0及NCBI内Primer Blast功能在NCBI上已公布的OsRSR1保守区设计高特异性引物及内参基因引物(表1)。参照并优化TaqSYBR®Green qPCR PreMix试剂盒使用说明配制特异PCR反应体系：PreMix混合缓冲液5.0 μL、模板1.0 μL、(10 μmol/L)上下游引物各0.2 μL，加ddH2O至10 μL。三步法PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40个扩增循环。反应结束后，基因拷贝数运用2-ΔΔCt法进行计算[11]。每个样品设置3次重复，数据为3次重复的平均值，以高亲系选1号抽穗后10 d表达量为1，计算其他供试材料的相对表达量。

1.4 OsRSR1克隆

采用改良冷酚抽提法提取水稻叶片的基因组DNA，依照TRIzol试剂说明书提取籽粒总RNA并纯化反转成cDNA。根据NCBI网站上公布的日本晴基因序列，通过Blast方法在水稻基因组Pfam数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中搜索目的基因，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，添加EcoR V酶切位点和保护碱基(表1)。参照PrimeSTAR GXL DNA Polymerase说明配制特异PCR反应体系：5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg+Plus)缓冲液2.0 μL、dNTP mixture(2.5 mmol/L each)0.8 μL、模板1.0 μL、(10 μmol/L)上下游引物各0.4 μL、(1.25 U/μL)PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min，38个扩增循环；68 ℃延伸10 min。反应结束后，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并回收目的片段，使用克隆试剂盒将目的片段与载体连接，采用热激法将构建的克隆载体QBV-3转化到DH5α中，将摇好的菌液瞬离去上清后均匀涂布在含有氯霉素(25 μg/mL)的LB固体培养基上，在37 ℃培养箱中倒置培养至单菌落长出。单菌落PCR鉴定正确的克隆活化摇菌，按照(EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit)试剂盒提取质粒，将质粒送至上海生工公司进行测序并进行序列比对分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used

注：划线处为EcoR V酶切位点，粗体为保护碱基。

Note：The line isEcoR V restriction sites，and the bold is protecting base.

2 结果与分析

2.1 灌浆不同时期胚乳OsRSR1表达量比较

由表2可知，6个供试材料在灌浆过程中籽粒OsRSR1表达量抽穗后10 d最大，然后迅速下降，其下降幅度龙稻8号是2.15倍，八十儿是5.40倍，其他材料是3.45～3.80倍，达到最低值后又逐渐上升，直至籽粒成熟，呈V字形变化趋势，最低值龙稻8号是出现在抽穗后30 d，其他供试材料是出现在抽穗后20 d，说明灌浆初始阶段和后期阶段OsRSR1表达量大，灌浆中期表达量小。灌浆各个时期6个供试材料按OsRSR1表达量由高到低排序依次为龙稻8号、东农1724、通769、系选1号、东农1701和八十儿，与该材料的籽粒直链淀粉含量高低排序正好相反，灌浆不同时期OsRSR1表达量与籽粒直链淀粉含量间呈负相关，其相关系数为-0.451～-0.899，其中抽穗后20，30，40 d的相关性达到极显著水平。由表2还可知，灌浆不同时期籽粒直链淀粉含量超高亲子代东农1701的OsRSR1表达量均显著低于高亲系选1号；籽粒直链淀粉含量超低亲子代东农1724的OsRSR1表达量在抽穗后30 d时显著高于低亲通769，其他时期都略高。说明OsRSR1表达量与籽粒直链淀粉含量间有密切关系，籽粒OsRSR1表达量高的品种其籽粒直链淀粉含量低，反之表达量低的品种籽粒直链淀粉含量高，二者间呈负相关关系，而且品种间有性杂交子代OsRSR1表达量会出现超亲变异。

表2 不同灌浆时期胚乳OsRSR1表达量及直链淀粉含量比较Tab.2 Comparison of OsRSR1 expression and amylose content in endosperm at different filling stage

注：同列数据后不同小写字母表示0.05水平差异显著。

Note：The Different lowercase letters after the same datas are significantly Different at 0.05 level.

2.2 供试材料OsRSR1克隆

在各供试材料中提取得到的总RNA的OD260/280值均约为1.95，而且各电泳条带很清晰，无降解(图1-A)。由图1-B可知，基因组DNA均呈单一条带，片段完整，与λDNA位置相同。说明本试验提取得到的总RNA和基因组DNA完全满足下游试验的质量要求。以该总RNA为模板逆转录得到第1链cDNA。然后分别以cDNA和DNA为模板，利用OsRSR1-1和OsRSR1-2引物进行扩增，在各供试材料中得到大小分别约为1 539，4 300 bp的特异预期片段(图2)。

M.DNA分子量标准；1-6.系选1号、通769、东农1701、东农1724、龙稻8号、八十儿。图2同。 M.DL 5K DNA Marker； 1-6 is Xixuan 1，Tong 769，Dongnong 1701，Dongnong 1724，Longdao 8，Bashier. The same as Fig.2.

图2 不同供试材料PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of OsRSR1 gene for different varieties

2.3 供试材料间OsRSR1 DNA克隆序列比对

6个供试材料的OsRSR1全长基因克隆序列运用DNAMAN与GenBank数据库已公布的日本晴RSR1全长序列进行比较，结果表明，其同源性均达99%以上，说明供试材料的OsRSR1全长序列克隆正确，可进行后续分析。

日本晴RSR1转录因子基因全长序列为4 300 bp，克隆得到的6个供试材料的OsRSR1全长序列亲本系选1号和通769及超亲子代东农1724为4 300 bp，超亲子代东农1701和籼稻品种八十儿为4 301 bp，糯稻品种龙稻8号为4 299 bp，说明不同材料间OsRSR1全长序列大小并不完全一致，有微小的差异。与日本晴的RSR1转录因子基因全长序列比较发现(图3)，高亲系选1号完全匹配，无SNP和In/Del变异；低亲通769在第1外显子有1个SNP；超高亲子代东农1701共有5处碱基发生变化，其中在5′端有3个In/Del，第1外显子和第7内含子各有1个SNP；超低亲子代东农1724共有2处碱基发生变化，第1外显子和3′端各有1个SNP；直链淀粉含量极低的糯稻品种龙稻8号在5′端有1个In/Del；直链淀粉含量极高的籼稻品种八十儿共有16处碱基发生变化，其中在5′端有1个SNP和2个In/Del，第1外显子有4个SNP 和1个In/Del，3′端有2个In/Del，在第3,5,6内含子均有1个In/Del，在第6,7,8外显子均有1个SNP。说明籽粒直链淀粉含量不同的水稻品种间OsRSR1全长DNA碱基序列并不完全一致，存在基因多态性，而且与亲本相比有性杂交后代DNA碱基序列无论是在外显子区还是内含子区都可发生变化。

图3 不同供试材料OsRSR1 DNA克隆序列比对(只显示差异部分)Fig.3 Alignment of DNA sequences of OsRSR1 in different materials(only show the difference part)

2.4 供试材料间OsRSR1 cDNA克隆序列比对

真核生物的基因最终是由外显子通过所编码的蛋白质表达性状或调控基因的转录表达，而内含子是转录后被剪切不表达。将图4中转录起始位点处的碱基A标记为+1，与日本晴RSR1转录因子基因编码序列相比，高亲系选1号在+1438位点处发生T→C的变化，三联体密码由TCC变为CCC，丝氨酸(S)变成脯氨酸(P)；低亲通769在+157位点处发生C→T的变化，三联体密码由CGC变为CGT，脯氨酸(P)变成丝氨酸(S)。与日本晴和亲本RSR1转录因子基因序列相比，超高亲变异后代东农1701在+160位点和+841位点处分别发生T→C和C→T的变化，三联体密码分别由CGT变为CGC和CGC变为CGT，对应氨基酸由丝氨酸(S)变成脯氨酸(P)和没变；超低亲变异后代东农1724在+395位点处发生A→G的变化，三联体密码由CAC变为CGC，组氨酸(H)变成精氨酸(R)。直链淀粉含量极低的糯稻品种龙稻8号与日本晴和超亲变异系相比，均未发生碱基和氨基酸的变化。直链淀粉含量极高的籼稻品种八十儿与日本晴和超亲变异系相比，共有8处碱基发生变化，依次是+122位点T→C，三联体密码由ATC变为ACC，异亮氨酸(I)变为苏氨酸(T)；+124位点G→A，三联体密码由GCG变为ACG，丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)；+160位点T→C，三联体密码由TGG变为CGG，丝氨酸(S)变为脯氨酸(P)；+173位点开始多了GCCGCC 6个碱基，多了2个丙氨酸(A)；+376位点C→T，三联体密码由CCC变为TCC，脯氨酸(P)变为丝氨酸(S)；+1032位点A→C，三联体密码由AGA变为AGC，精氨酸(R)变为丝氨酸(S)；+1173位点C→T，三联体密码由GCC变为GCT，对应氨基酸没变；+1 386位点C→G，三联体密码由TCC变为TCG，对应氨基酸没变。说明籽粒直链淀粉含量不同的水稻品种间mRNA碱基序列和氨基酸序列并不完全一致，存在着多态性，而且通过有性杂交产生的超亲变异后代在基因分离和稳定过程中某些位点上发生的碱基变化可形成同义或非同义的三联体密码。

图4 不同供试材料OsRSR1 cDNA序列比对(只显示差异部分)

2.5 供试材料间OsRSR1 DNA和cDNA克隆序列比较

将日本晴和6个供试材料中克隆得到的OsRSR1 DNA序列和cDNA序列的碱基变化及变化位点比较结果列于表3。

由表3可知，在供试材料中克隆得到的DNA序列和cDNA序列在编码区发生的碱基变化位点共有7处相同和6处不同。其中碱基变化位点相同的在第1外显子有4处，分别对应DNA和cDNA位点的686-122、688-124、737-173、940-376；在第6,7,8外显子各有一处，分别对应DNA和cDNA位点的2 317-1 032、2 852-1 173和3 815-1 386。碱基变化位点不同的又分为只在DNA克隆序列上发生变化和只在cDNA克隆序列上发生变化2种，其中变化只发生在DNA克隆序列上的位点为724，只发生在cDNA克隆序列上的变化位点在第1外显子有3处，分别对应cDNA位点的157、160和395；在第3和第8外显子分别有一处，分别对应cDNA位点的841和1 438。

超亲变异材料中的超高亲子代东农1701与亲本相比，发生碱基变化的位点既有同时发生在DNA和cDNA克隆序列上的如686-122，也有只在DNA克隆序列碱基位点724和只在cDNA克隆序列碱基位点160发生的变化；超低亲子代东农1724只分别在DNA克隆序列碱基位点724和cDNA克隆序列碱基位点395发生碱基变化。说明在DNA序列上发生变异的碱基正常转录成mRNA序列，形成与DNA序列匹配的mRNA碱基序列，而且在转录过程中也发生个别碱基的变化，形成与DNA碱基序列不配的mRNA碱基序列，最终形成同义或非同义的三联体密码，是性状产生遗传变异和基因多态性的重要途径。

表3 不同供试材料OsRSR1 DNA和cDNA碱基变化比较Tab.3 Comparison of DNA and cDNA sequences of OsRSR1 in different materials

注：同列*表示没有对应位点；同行×表示该位点没有碱基；下划线表示碱基发生变化。

Note：In the same column，*means there is no corresponding locus；In the same column，×means there is no base；The underscore indicates a change in the base.

2.6 供试材料间OsRSR1结构比较

在NCBI的ORF Finder在线分析网站上分析6个供试材料OsRSR1克隆序列结果如图5所示。八十儿的OsRSR1含一个长1 545 bp的ORF(Open reading frame，开放阅读框)，编码514个氨基酸；其他5个供试材料含一个长1 539 bp的ORF，编码512个氨基酸。

利用Protfun(http：//www.cbs.dtu.dk/Services/ProtFun/)软件对OsRSR1蛋白功能进行预测分析，结果表明，OsRSR1蛋白有14种功能，其中转录和转录调控功能的预测值和概率均最高(表4)，说明该基因的主要功能是调控其他基因的转录表达。

图5 OsRSR1基因编码氨基酸序列结构域的预测Fig.5 Putative protein structure domains of amino acid sequence encoded by RSR1 gene in rice

功能分类 Functional category预测值 Probability概率 Odds信号转导 Signal transducer0.0740.346受体 Receptor0.0030.020激素 Hormone0.0010.206结构蛋白 Structural protein0.0020.064运载体 Transporter0.0250.228离子通道 Ion channel0.0100.181电压门控离子通道 Voltage gated ion channel0.0040.178阳离子通道 Cation channel0.0100.215转录 Transcription0.2091.631转录调控 Transcription regulation0.2081.665胁迫应答 Stress response0.0100.119免疫应答 Immune response0.0120.137生长因子 Growth factor0.0412.910金属离子转移Metal ion transport0.0090.020

采用SMAET数据库对OsRSR1基因编码氨基酸序列的蛋白结构域进行分析结果表明，水稻OsRSR1由8个外显子和7个内含子组成，与PhotoZome中日本晴RSR1基因结构相同，说明该基因序列的碱基变化均未改变基因的完整结构。OsRSR1蛋白结构中包含完整的DNA结合结构域，分别位于171-233和263-326位点间高度保守的AP2/EREBP Domain元件，是由大约57-70个氨基酸残基组成，与谢永丽[12]报道的AP2/EREBP转录因子基因家族的AP2亚族相一致。该结构域N-端具有碱性和亲水性的YRG是由约20个氨基酸残基组成的一段高度保守序列，具有3个反向平行的β-折叠，对识别各类顺式作用元件并与之相互结合起关键作用；C-端约含有40个氨基酸残基的RAYD调节AP2/EREBP结构域与DNA的结合；在C-端还具有L/FDLNL/F(X)P类型的EAR模体，在转录因子某些调控途径中发挥抑制作用(图6)。通过比较分析发现(图6)，6个供试材料的个别氨基酸变异均未发生在AP2 Domain和EAR模体区域内，说明籽粒直链淀粉含量差异显著的6个供试材料间的氨基酸差异并没导致OsRSR1蛋白的基本元件和功能变化，该蛋白结构域保守性很强。

3 讨论与结论

3.1 关于转录因子基因与性状遗传变异

水稻胚乳淀粉合成调节因子OsRSR1(RiceStarchRegulator1)是AP2/EREBP响应元件结合蛋白家族的转录因子，负调控淀粉合成关键酶基因的表达[13]，在水稻种子发育中起着必不可少的作用[14-16]。在rsr基因突变体中胚乳淀粉合成基因表达量均被上调，种子中直链淀粉含量增加，支链淀粉显微结构改变，形成松散的圆形淀粉颗粒，最终导致淀粉糊化温度降低[13]。在小麦籽粒灌浆过程中TaRSR1基因的表达量与淀粉合成酶基因中第2组基因(TaAGPS1-a、TaAGPL1、TaGBSSI、TaSSI、TaSSIIa、TaSSIV、TaBEI、TaBEIIb、TaPUL、TaPHOL和TaDPE1)表达量呈负相关[8]。刘海英等[17]通过RNAi技术干扰RSR1基因的转录表达，结果表明，OsRSR1-RNAi转基因植株与野生型对照相比，转基因植株的RSR1基因mRNA表达量显著下降，而籽粒OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPS2、OsGBSSI、OsSSSI、OsSSSIV-2和OsSBE3等淀粉合成关键酶基因表达量和胚乳直链淀粉含量均极显著增加，RSR1基因的表达量与胚乳淀粉合成相关基因的转录表达量和直链淀粉含量间呈负相关关系。本试验结果表明，在灌浆过程中籽粒OsRSR1表达量呈V字形变化趋势，灌浆初始阶段和后期阶段表达量大，灌浆中期表达量小，与灌浆中期表达量最大，且呈单峰曲线变化趋势的OsSBE1、OsSBE3、OsSSSⅠ、OsSSSⅡ-1、OsSSSⅡ-3、OsSSSⅢ-1、OsSSSⅢ-2、ISA1、ISA3等淀粉合成关键酶基因正好相反[18-20]，而且灌浆不同时期OsRSR1表达量与籽粒直链淀粉含量间呈显著负相关，且籽粒直链淀粉含量超高亲子代和超低亲子代的OsRSR1表达量在灌浆各时期均低于高亲或高于低亲，即该基因转录表达量出现与籽粒直链淀粉含量同样的超亲变异现象。说明OsRSR1的表达量和胚乳淀粉合成相关基因的表达量及直链淀粉含量间是同步变化关系。mRNA序列上的碱基变异能引起由该基因编码合成的蛋白质氨基酸序列的变化，以致蛋白质功能的变化，进而导致最终产物的合成与积累或表观性状的遗传变异[18]。因此，蛋白质结构与功能发生变化是基因最终表观性状变异的重要前提。由本试验对OsRSR1全长DNA和cDNA序列比较分析结果可知，虽然供试的6个材料间或子代与亲本间比较都发生了个别碱基和氨基酸的变化，但由OsRSR1蛋白结构域分析结果却可知，6个供试材料的氨基酸变异均未发生在AP2 Domain和EAR模体区域内，籽粒直链淀粉含量差异显著的6个供试材料间的氨基酸差异并没导致OsRSR1蛋白的基本元件和功能变化，表明供试材料间籽粒直链淀粉含量的显著差异可能与已发生的个别氨基酸变异没关系。淀粉合成关键酶基因表达量和酶活性及直链淀粉含量变化是同步变化关系，即转录表达量的增加提高了酶活性和直链淀粉含量[18-20]。在本试验中，OsRSR1表达量变异引起的下游淀粉合成相关酶基因转录表达量变异及酶活性变化是供试材料间籽粒直链淀粉含量存在差异甚至产生超亲变异的主要内在因素。因此，转录因子基因通过自身转录表达量的变化调控下游结构基因的转录表达量，进而激活或抑制与结构基因关联的酶活性，是品种间有性杂交子代表观性状发生遗传变异或超亲遗传变异内在调控机制之一。

图6 不同供试材料OsRSR1氨基酸序列比对Fig.6 Alignment of amino acids sequences of OsRSR1 in different materials

3.2 关于遗传密码变异途径

生物的遗传信息储存在基因的DNA碱基序列中，不同的碱基序列编码合成相同或不同的氨基酸序列，进而形成功能各异的结构蛋白或功能蛋白，最终表达该基因的遗传信息。因此，基因碱基序列的变异是生物产生遗传变异和基因多态性的内在因素，深入分析基因碱基序列的变异机理对阐明生物遗传变异的内在机制具有重要意义。从本试验籽粒直链淀粉含量差异极显著的供试材料间OsRSR1全长DNA和cDNA序列比较可知，不同品种间OsRSR1碱基序列无论是在数量上还是在质量上都有微小或大的差异，导致该基因具有丰富的多态性。以DNA为模板按照碱基配对的方式转录产生mRNA，进而翻译成氨基酸序列是遗传信息的正常表达过程。因此，DNA碱基序列的变异导致mRNA序列和氨基酸序列变异是很正常的遗传变异发生过程。

已有研究表明，SNPs、In/Del和结构上的变化是大多数生物基因组中最多的变异[21]，且碱基片段的插入或缺失在内含子区域时与表型特征变异密切相关[22]。江苏水稻巨胚种质基因的克隆发现，GE基因碱基序列有3个位点发生变化，第1 090位点由C→G；第1 302位点由T→G；第1 467位点由G→A，并提前形成终止密码子TGA；10 217个巨胚基因中ge基因是新的GE等位基因，表明基因在个别位点上碱基的变化导致基因功能的变化，最终表现性状的遗传变异[23]。Sun等[24]通过克隆豌豆2258叶绿体GS2的cDNA，得出ORF为1 293 bp，推测其氨基酸为431 bp，将其与Tingey公布的豌豆叶绿体GS2的cDNA序列和氨基酸序列进行比对，发现二者有4个碱基发生变化，分别位于4个三联体密码中，却只有1处对应的氨基酸发生变化，其他均为同义突变。由本试验结果可知，直连淀粉含量差异显著的6个供试材料间OsRSR1全长DNA序列和cDNA序列同源性高达99%以上，氨基酸序列保守性也很强，但仍有个别位点发生碱基和氨基酸序列的变化。其中全长DNA克隆序列中，5′非编码区、外显子、内含子和3′非编码区均有个别碱基的变化，cDNA克隆序列也同样发生个别碱基的变化，但两者间变化的位点和碱基既有相同的位点，也有不同的位点，并最终形成的三联体密码和氨基酸也有相同的密码和氨基酸，也有不同的密码和氨基酸，表明基因组的DNA碱基序列转录成mRNA过程中也产生碱基的变异。然而，碱基的这种变异难以从DNA碱基序列预测，具有偶然性，是生物产生遗传变异的另一种重要内在机制。由于mRNA序列上的一个碱基变化也能引起蛋白质的功能变化，因此，深入分析其产生这种变异的机制对阐明性状变异的分子调控机制具有重要意义。