槐果碱抗心律失常的电生理机制研究

董扬　张芬　王文标

[摘要] 目的 探討槐果碱对心肌细胞动作电位（action potentials，AP）及离子电流的电生理效应。 方法 将豚鼠心脏快速取出后通过心电图记录心脏对槐果碱的应答；采用常规微电极技术对豚鼠乳头状肌或兔窦房结细胞快反应及慢反应动作电位进行记录，研究槐果碱的相关效应；获取新生大鼠心室心肌细胞进行原代培养，采用膜片钳技术记录全细胞及单通道电流；采用穿孔膜片钳技术进行全细胞钙流记录。 结果 在异丙肾上腺素诱导后出现心动过速，而槐果碱（300 μmol）加入后，心动过速或室颤现象消失，心电图提示出现正常心跳。对于豚鼠心室心肌细胞的快反应动作电位，槐果碱作用后，APD及动作电位的有效不应期延长，APA下降。对于窦房结的慢反应动作电位，槐果碱处理后，APA及Vmax均出现下降，且APD90也能够延长。结果显示槐果碱通过阻断Ikr而非Iks实现对APD的延长。新生大鼠心室细胞的细胞电流实验结果显示10 μmol/L槐果碱能够导致INa下降约18%。且槐果碱能够在全体细胞水平上降低慢内向电流，尾部电流（外向K+电流）也出现消失，相比于对照组，ICaL在20 mV指令电位时，平均减少（33.2±11.7）%。 结论 槐果碱能够逆转异丙肾上腺素引起的心律失常，其作用机制为抑制Na离子、钙离子及钾离子电流。

[关键词] 槐果碱；心肌细胞；动作电位；离子电流

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）19-0026-05

Study on the electrophysiological mechanism of sophocarpine against arrhythmia

DONG Yang ZHANG Fen WANG Wenbiao LIU Jun

Department of Cardiology， Jinhua Peoples Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To investigate the electrophysiological effects of sophocarpine on cardiomyocyte action potentials（AP） and ion currents. Methods The heart of guinea pigs was quickly removed and response of heart to sophocarpine was recorded by electrocardiogram. The conventional microelectrode technique was used to record the fast response and slow response action potentials of guinea pig papillary muscles or rabbit sinoatrial node cells， and the related effects of sophocarpine were investigated； neonatal rat ventricular cardiomyocytes were obtained for primary culture. Patch-clamp technique was used to record whole-cell and single-channel currents； perforated patch-clamp technique was used to record whole-cell calcium flow. Results Tachycardia occurred after isoproterenol induction， and after sophocarpine（300 μmol） was added， tachycardia or ventricular fibrillation disappeared. Electrocardiogram indicated a normal heartbeat. For ventricular cardiomyocytes fast response action potential in guinea pigs， after the sophocarpine was given， the effective refractory period of APD and action potential was prolonged， and APA was decreased. For the slow response action potential of the sinus node， after sophocarpine was given， APA and Vmax were both decreased. APD90 could also be prolonged. The results showed that sophocarpine extended APD by blocking Ikr instead of Iks. The experimental results of cell currents in neonatal rat ventricular cells showed that 10 μmol/L sophocarpine could cause INa to decrease by about 18%. Moreover， sophocarpine could reduce the slow inward current at the whole cell level. Tail current（outward K+ current） also disappeared. ICaL was decreased by an average of （33.2±11.7）% at a 20 mV command potential compared to the control group. Conclusion Sophocarpine can reverse isoproterenol - induced arrhythmia. Its mechanism of action is to inhibit the currents of Na+， Ca2+ and K+.

[Key words] Sophocarpine； Myocardial cells； Action potentials； Ion currents

心律失常是由离子通道异常引起的一种疾病，尽管已经被研究多年，其迄今仍为一种能够导致生命危险的疾病[1-3]。有研究认为心律失常由心脏病导致，如心衰和心肌缺血。心梗患者往往因心动过速或室颤更易出现突发性心脏死亡。目前已有多种药物被认为能够用于治疗心律失常，然而这些药物因其相关的副作用如心脏抑制及促心律失常效应而使用受限[4-6]。近来研究提示，能够避免这些严重心脏副作用的天然复合物可能能够用于心律失常的治疗[7-10]。

苦参作为一种中药在中国已有千年的使用史。其包含多种类型的生物碱，主要有苦豆碱、苦参碱及槐果碱[11，12]。有研究提示苦参具有抗心律失常的效应。Zhang等[13]研究提示从苦参中提炼的槐果碱是一种治疗病毒性心肌炎的有效药物，其不仅具备抗病毒效应，而且同时具备抗心律失常的效应。Chen等[14]研究提示，期外收缩患者在采用槐果碱治疗后，有89.7%的患者出现了心律失常恢复的情况。该结果提示槐果碱具有抗心律失常的效应，然而有关其机制尚不明确。在本研究中，通过研究槐果碱对心脏、心肌细胞及离子通道的效应来明确槐果碱的电生理性质并探索其抗心律失常功能的机制。本文中所有涉及到的動物实验均符合本院动物福利，并获得动物使用委员会的批准。

1 材料与方法

1.1 溶液配制

用于灌注的台式液（Tyrodes）溶液的配方如下（mM）：NaCl：138；KCl：5.4；CaCl2：1.8；MgCl2：1；glucose：10；HEPES：10；pH：7.4。用于全部细胞Na+电流记录的电极液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.2。水浴溶液采用上述Tyrodes液。用于内向外Na+通道电流记录的水浴溶液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.4。电极液配方如下（mM）：NaCl：180；KCl：1.3；CaCl2：1.5；MgCl2：0.5；glucose：5；HEPES：5；CoCl2：3；TEA：10；4-AP：10；CsCl：10；pH：7.2。用于穿孔膜片钳电极液的配方如下（mM）：K-aspartate：130；MgCl2：2；CaCl2：5；EGTA：1.1；Na-HEPES：10；Na2-ATP：2；pH：7.2。实验中两性霉素的使用浓度为240 μM。

槐果碱来自上海医药工业研究院。槐果碱注射液购自于上海禾珈药业公司，注射液浓度为10 g/L。Chromanol 293B购自德国Aventis Pharma公司，采用DMSO溶解至浓度为10 mmol/L。多菲力特（dofetilide）购自于英国EGIS药物公司。

1.2 离体豚鼠心脏心电图测试

采用体重为250～300 g的豚鼠（雌雄各半）进行实验[动物许可证号SYXK（浙）2012-0178]，将豚鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的乌拉坦溶液进行麻醉。将心脏快速取出后采用Langendorff灌注设备在80 cm水柱压力下进行记录。Tyrodes液的温度维持在37°C。将三个铂电极分别置于心尖、右心房及主动脉根部位用于心电图的记录。采用装有PowerLab system软件的电脑进行信号的记录。

1.3 新生大鼠心室心肌细胞的原代培养

根据之前文献报道的内容进行[15，16]，采用1日龄的新生大鼠（雌雄各半）进行实验，将大鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的乌拉坦溶液进行麻醉。将心脏取出后，将心室切成小块后，采用含胶原酶的溶液进行消化。离心两次后从细胞悬液中获得心肌细胞，将离体的心室肌细胞接种到含有10% 胎牛血清的DMEM培养液的玻璃盖玻片上生长5～6 d。

1.4 豚鼠乳头状肌及家兔窦结节的制备

采用体重为250～300 g的豚鼠（雌雄各半）及体重为1.5～2.5 kg的家兔进行实验，将动物采用静脉注射浓度为30 mg/kg的戊巴比妥钠进行深度麻醉后，通过静脉放血进行处死。将心脏快速取出后迅速放入充满Tyroses液的分离槽。将右心室乳头状肌肉或含部分左心室的窦结节切碎并以不锈钢钢针固定于灌流槽底部。灌流槽维持在37°C情况下，采用3 mL/min的Tyroses液进行灌流。

1.5 快反应及慢反应动作电位记录

采用双铂电极对乳头状肌肉及窦房结分别采用频率为1.1 Hz及2.2 Hz的矩形电流脉冲进行驱动。每次脉冲的持续时间为0.1 ms，强度为阈值的1.5 倍。在刺激30 min后，跨膜动作电位采用浸没于3M KCl溶液的常规玻璃微电极（其中电极头部电阻为15～20 MΩ）。通过装配放大器及PowerLab界面软件的电脑进行采用和存储。快反应动作电位的计算参数包括静息电位（resting potential，RP）、动作电位幅度（amplitude of action potential，APA）、最大去极化速率（Vmax）、动作电位时程（action potential duration，APD）及有效不应期。为了检测有效不应期，将豚鼠制备物采用频率为1 Hz的系列脉冲连续刺激8次。在最后一次脉冲后，加入1次其他测试脉冲。通过调节8次脉冲及测试刺激的时间间隔，能够用以诱导的额外动作电位，最短的时间间隔被记录为有效不应期。

1.6 膜片钳实验

采用膜片钳技术来记录全细胞及单通道电流。细胞采用之前提及Tyrodes液进行灌注，流速为3 mL/min。采用穿孔膜片钳技术进行全细胞钙流记录，其优点在于能够阻断钙电流的衰减。灌注液中的4-AP能够用于阻断瞬时外向电流（Ito）显示钙离子电流。采用示波器及Axopatch-1D放大器来监视和记录钳制电压和通道电流。采用Clampex 9.0 软件进行数据的采集，通过Digidata1320进行数据记录。采样速率为100 kHz、滤过频率为10 kHz。

1.7 统计学分析

所有数据采用SPSS13.0软件进行分析。连续性计量资料采用均数±标准差表示。两组和多组数据比较分别采用t检验及方差分析进行检测。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐果碱抗心律失常作用研究结果

在心动过速的模型中，将心脏首先采用含15 μmol/L异丙肾上腺素Tyroses液进行灌注6～8 min。随后，当心动过速及室颤开始出现后立即进行记录。随后将槐果碱加入到上述灌注液中。11～17 min后，心动过速或室颤现象消失，心电图提示出现正常心跳。本实验共重复6次。全部豚鼠均在异丙肾上腺素诱导后出现心动过速，而槐果碱加入能够抑制心动过速。异丙肾上腺素能够将心率从（175±23）次/min增加到（218±26）次/min，从而引起心动过速的出现，而槐果碱能够将心率恢复到（179±24）次/min并最终使心动过速停止。将槐果碱洗去后能够将心率恢复到（207±28）次/min。

2.2 槐果碱对心室细胞快反应动作电位的效应

在豚鼠乳头状肌的动作电位稳定后，采用含不同浓度槐果碱的Tyroses液进行灌注。每次灌注持续的时间约8～10 min，同时检测RP、APA、Vmax及APD。通過加到动作电位不同去极化期额外的上限阈值的刺激来确定有效不应期。当通过槐果碱延长APD及动作电位的有效不应期时，APA出现下降（表1）。为了检测APD与槐果碱之间的剂量效应，槐果碱的使用浓度范围为1～100 μmol/L。使APD90延长的EC50为5.93 μmol/L。

2.3 槐果碱对兔窦房结慢反应动作电位的效应

为了明确槐果碱对窦房结的慢反应动作电位，将兔窦房结采用速率为130 次/min的电极刺激进行处理。采用玻璃电极对刺激后的动作电位进行记录[17]。槐果碱诱导动作电位参数的变化见表2及表3。当采用不同浓度槐果碱处理后，APA及Vmax均出现下降。此外，APD90能够通过槐果碱进行延长，与快反应动作电位的记录结果一致。

2.4 槐果碱延长APD的可能机制研究结果

通过chromanol 293B来特异性阻断Iks，dofetilide阻断Ikr。在实验中，先将chromanol 293B用于阻断Iks，随后采用不同浓度的槐果碱加入到灌注液中。结果显示由chromanol 293B诱导的APD延长能够由槐果碱进一步延长，该结果提示槐果碱能够通过抑制Ikr来增加APD。为了进一步验证该结果，本文进一步采用dofetilide来阻断Ikr，从而实现APD的增加，随后将不同浓度的槐果碱加入到灌注液中。槐果碱对APD的效应在dofetilide处理的情况下消失。结果提示槐果碱通过阻断Ikr而非Iks来实现对APD的延长，见图1。

2.5 槐果碱对心肌细胞INa的调节作用

采用酶分离消化的新生大鼠心室细胞对细胞电流进行记录，将细胞从控制电位（-110 mV）向静息电位（-50 mV）进行去极化，时长为300 ms。通过去极化过程诱导较大内向电流，该电流被视作INa[18]。当细胞采用10 μmol/L槐果碱灌注后内向电流减少。结果显示10 μmol/L槐果碱能够导致INa下降约18%。

2.6 槐果碱能够对心肌细胞ICaL的调节作用

通过穿孔钳采用全部细胞进行记录。首先将新生大鼠心室细胞在-40 mV条件下将Na+离子通道失活，随后将细胞去极化到20 mV指令电位，时长为500 ms。由于4-AP用于阻断Ito，内向电流能够在指令电位时进行辨识。随后将10 μmol/L槐果碱加入到灌注液中。3 min后，内向电流出现减少，尾部电流（外向K+电流）也出现消失。相比于对照组，ICaL在20 mV指令电位时，平均减少（33.2±11.7）%。

3 讨论

在本研究中，通过研究槐果碱对心脏、心肌细胞及离子通道的效应来明确槐果碱的电生理性质并探索其抗心律失常功能的机制。本文结果显示异丙肾上腺素（15 μmol）引起的心律失常能够通过槐果碱（300 μmol）进行逆转。槐果碱能够降低4.0%的振幅，24.4%的快速应答动作电位最大去极化动作电流及18.8%的Na离子电流，延长有效不应期为21.1%。

0期快反应动作电位由快速内向Na+电流进行启动。本文实验证实槐果碱能够抑制INa，这就能够解释为何槐果碱能够在快反应动作电位时将APA和Vmax进行降低。在内向外记录实验中，K+和Ca2+通道能够通过CoCl2、TEA、4-AP及CsCl进行阻断；因此，本实验中获得的内向电流为Na+电流。槐果碱处理能够降低Na+通道电流的开放及大小，该结果提示槐果碱对Na+通道具有抑制效应。

槐果碱能够在全体细胞水平上降低慢内向电流，即ICaL。慢ICaL能够启动慢反应动作电位（包括窦房结中的动作电位）。慢反应动作电位APA及Vmax依赖于Ca2+离子通道的动态变化情况。槐果碱能够引起APA及Vmax，从而引起槐果碱对Ca2+离子通道的抑制效应。

APD被认为主要与内向ICaL及外向的K+电流相关。本文结果显示槐果碱能够在快反应动作电位及慢反应动作电位的情况下延长APD，该结果提示槐果碱能够抑制外向的K+电流，该电流可能导致APD再次极化及延长。槐果碱介导的K+电流抑制可见于槐果碱介导的K+尾流减少。有必要指出的是，当采用chromanol 293B来阻断Iks，槐果碱能够以剂量依赖的方式延长APD；然而，当通过dofetilide阻断Ikr，槐果碱无法延长APD。虽然该结果并不能排除是否Ikr能够参与到该过程中，但本研究结果与之前Yang等[19]在其关于槐果碱对表达HERG通道的293细胞的效应一致，其结果证实槐果碱能够通常影响失活态来抑制HERG通道[19]。

槐果碱对L-型钙电流具有降低效应，而L-型钙电流被认为能够缩短APD90并干扰槐果碱对APD的延长效应[20]，目前的研究认为胞浆钙离子浓度升高激活能够促发两种不同的再次极化电流。IkCa作为其中一种，为钾离子Kv家族成员；而另一种Ito2则可能为钙激活氯离子通道。这两种电流均能夠对胞浆钙离子浓度升高进行应答，其机制为缩短动作电位时程，限制钙流进一步流入心脏。基于此，本研究认为槐果碱对IkCa效应较小，其更倾向于延长APD。

本文也存在一些不足之处，槐果碱对异丙肾上腺素引起的心动过速具有明显的抑制效应，但仍不明确其电生理特性是否在其中发挥作用。异丙肾上腺素诱导的心动过速的机制较为复杂。有关是通过去极化后延迟还是通过再进入机制还是通过改变心律仍不明确，仍需要进一步的研究来证实。

综上所述，本文结果证实槐果碱能够逆转异丙肾上腺素引起的心律失常，其作用机制为抑制Na离子、钙离子及钾离子电流。

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（收稿日期：2017-10-16）