黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中Ig蛋白重链表达与IgH基因重排的研究

林海月，王红霞，胡东东，陈 昊△

(江苏省连云港市第一人民医院/徐州医科大学附属连云港医院:1.病理科；2.妇产科，江苏连云港 222002)

近年来黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALToma)发病率有所提高，居非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin′s lymphoma,NHL)的第二位[1-2]，因缺乏特征性的免疫标记，仍属于排他性诊断。MALToma与反应性淋巴组织增生(reactive lymphoid hyperplasia，RLH)的鉴别尤其困难，而两者的鉴别直接影响患者的治疗及预后，意义重大。本研究以MALToma与MALToma细胞起源接近的滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、同为生发中心后B2谱系的浆细胞淋巴瘤(plasmacytoma，PC)为研究对象，立足于Ig蛋白重链可变区的IgH基因重排与重链恒定区的抗体类别转换，分

表1 试验组及对照组中各种Ig蛋白重链表达情况及表达模式[n(%)]

a:试验组间比较；b：试验组各肿瘤分别与对照组比较;c:Fisher检验；d:试验组与对照组比较；▲:IgE在各组中均为阴性表达，因而不列入表中;-:此项无数据

析IgH基因重排与Ig重链表达的情况，以期找到有利于MALToma诊断和鉴别诊断的新方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集江苏省连云港市第一人民医院病理科2009年6月至2016年11月存档蜡块B细胞NHL(B-NHL)50例(包括MALToma 30例、FL 10例、PC 10例)作为试验组，另选取RLH 10例作为对照组。参照第四版造血与淋巴组织肿瘤WHO分类诊断标准，所有病例经两位高年资病理医师复核诊断，将MALToma、FL、PC和RLH依病理号从MI、FI、PI、RI开始依次编号。30例MALToma中，男14例，女16例，年龄28～77岁，中位年龄60.5岁，参照 Ann Arbor临床分期，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为16、11、1、2例；依据国际预后指数(IPI)危险度分级分为低危组20例、中危组9例、高危组1例。FL中男3例，女7例，年龄46～80岁，中位年龄61.5岁；PC中男3例，女7例，年龄45～72岁，中位年龄63.5岁；RLH中男6例，女4例，年龄39～76岁，中位年龄59岁。对30例MALToma患者进行电话随访，随访时间截止于2017年6月19日，21例获得随访资料，随访33～418周，疾病进展6例，死亡1例，无进展生存期(progression free survival,PFS)为33～143周。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学 全部标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，苏木素-伊红(HE)染色。采用EnVision两步法检测两组中Ig蛋白重链表达，操作流程严格参照试剂说明书要求。IgM、IgA、IgD、IgG为即用型工作液(购自广州安必平医药科技股份有限公司)，IgE为浓缩液(购自Abcam公司)，以1∶500倍稀释，均为兔抗人抗体。

1.2.2PCR QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购于Qiagen公司，IgH基因重排试剂盒(包括IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE占管引物)购于InvivoScribe公司，Taq酶购于ABI公司，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及GelRed等试剂均购于北京思尔成生物技术有限公司，操作流程严格参照说明书要求。

1.3结果判定 免疫组织化学判读标准：5种Ig蛋白阳性染色均为细胞质出现棕黄色颗粒，每张切片选取5个具有典型病变的视野(×100)，各视野计数200个细胞，按照半定量积分法分为阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。IgH基因重排判读标准：(1)电泳条带边缘整齐，宽度不超过1 mm；(2)产物在期望范围内；(3)如若背景上无涂抹带，同时也无引物二聚体即是扩增失败，而不是出现阴性结果；(4)期望范围以外的其余条带，则为人工假象。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件对结果进行统计学分析，采用χ2检验进行组间阳性率的比较，采用Spearman进行相关性分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1试验组与对照组中Ig蛋白重链表达及IgH基因重排情况 研究中将Ig重链表达分为3种模式，模式1：单种Ig重链表达；模式2：全阴性Ig重链缺失表达；模式3：多种Ig重链表达。试验组及试验组3种肿瘤模式1/2检出率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。3种肿瘤、试验组及对照组中5管引物检出率及组合检出率见表2。试验组(74.0%)及对照组(0)中IgH基因单克隆重排检出率差异有统计学意义(χ2=16.301，P<0.05)；生发中心来源的MALToma(73.3%)和PC(70.0%)略低于生发中心来源的FL(80.0%)，但试验组3种肿瘤间比较差异无统计学意义(χ2=0.285，P>0.05)。IgH基因重排电泳图见图1。

2.2试验组中IgH基因重排与Ig蛋白重链表达模式的关系 试验组及试验组3种肿瘤中IgH基因重排阳性组、阴性组中Ig重链模式1/2与模式3的检出率间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；IgH基因单克隆重排检出率和Ig重链模式1/2检出率亦无相关性(P>0.05)，见表3。将IgH基因检测阳性或Ig重链表达呈模式1/2的病例均计为阳性，两者联合检测在试验组及MALToma、FL、PC中的阳性率显著升高，分别为94.0%(47/50)、96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)。

2.3MALToma中Ig蛋白重链表达模式及IgH基因重排与预后相关参数(临床分期、危险度分型、无疾病进展期)的关系 本研究将Ig蛋白重链表达呈模式1/2计为方法一阳性，IgH基因呈单克隆重排计为方法二阳性，两者联合检测任何一种出现阳性均计为方法三阳性，3种方法在不同临床分期和危险度分型中差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。Ig蛋白重链不同表达模式及IgH基因检测阳性与阴性组中PFS的差异无统计学意义(P>0.05)。生存曲线见图2。

表2 各组IgH基因重排结果[n(%)]

E管在209 bp处出现非特异性单克隆条带

表3 试验组中IgH基因重排与Ig蛋白重链表达模式的关系[n(%)]

a:IgH基因重排阳、阴性组间模式1/2检出率的比较；b:IgH基因重排与Ig蛋白重链表达模式1/2、模式3的相关性分析；c：Fisher检验

图A、B、C为M1、M2基因重排电泳图;A-、A+、B-、B+、C-、C+、D-、D+、E-、E+分别为IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE的阴性和阳性对照，M1为A、B、D管阳性，M2为B、C管阳性。阳性条带范围：IgHA为310～360 bp，IgHB为250～295 bp，IgHC为100～170 bp，IgHD为110～290 bp，390～420 bp，IgHE为100～130 bp。图C：IgHE在209 bp处出现非特异性条带

图1 MALToma基因重排电泳图

续表4 MALToma中Ig蛋白重链表达模式及IgH基因重排与预后相关参数的关系[n(%)]

a：Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期间阳性率比较；b：Fisher检验

A:IgH基因；B：Ig蛋白重链

图2 IgH基因检测阳性与阴性组及Ig蛋白重链模式1/2与模式3间PFS的比较(P=0.681、0.183)

3 讨 论

B细胞在发育过程中在骨髓中首先发生Ig重链可变区VDJ基因重排，然后发生Ig轻链VJ基因重排，转录成RNA后再与重链恒定区转录的RNA并接成Ig分子，形成表达mIgM和mIgD的成熟B细胞后即进入外周免疫器官，经抗原刺激后于生发中心发生体细胞超突变和抗体类别转换[3]。所谓抗体类别转换即B细胞发生Ig重链恒定区的二次基因重排，由原先合成IgM和IgD的B细胞转变为合成IgG、IgA或IgE的B细胞。根据肿瘤的单克隆学说，B细胞淋巴瘤应发生重链可变区IgH基因的单克隆重排，重链恒定区Ig蛋白编码基因的单克隆重排并表达单种Ig蛋白重链。理论上，Ig重链可变区和恒定区均可作为检测B细胞淋巴瘤单克隆性的两个靶点，对于两者关系的研究甚少。

一直以来国内外对于MALToma中Ig蛋白重链表达特点的研究较少，理论上肿瘤为单克隆增生，应为表达模式1。BENDE等[4]关于MALToma的研究中模式1阳性率达80%(16/20)，而有学者对弥漫性大B细胞淋巴瘤Ig蛋白表达的研究得出模式2(15/30)及模式3的表达(4/30)[5]，模式2/3的表达可能是由于肿瘤细胞Ig蛋白表达失调所致。本研究中MALToma、PC、FL及试验组模式1/2阳性检出率分别为86.7%、80.0%、60.0%、80.0%，RLH均表达模式3(P<0.05)，模式1/2的表达有助于试验组3种肿瘤(尤其是MALToma)与RLH的鉴别诊断，因而笔者推测其为肿瘤特有，将其作为肿瘤的提示标记。IgH基因重排是B细胞分化过程中首先发生的事件，人们较常运用Biomed-2引物系统中针对IgH的5管引物检测肿瘤的单克隆性[6]。受体细胞超突变的影响，生发中心前细胞来源的肿瘤单克隆重排检出率高于生发中心及生发中心后来源的肿瘤[7]。本研究中3种肿瘤及试验组IgH基因重排阳性率均达70%以上，与KOKOVIC等[8]、张婧等[9]的研究相符，因而Biomed-2引物系统对于B-NHL单克隆性的检测具有重要的临床病理应用价值。多数研究中IgH E管阳性率较低甚至为0[10-12]，本研究试验组及对照组IgH E管均未检出单克隆重排，因而笔者不推荐使用。关于IgH基因重排检测与Ig蛋白重链表达的研究少见相关报道，本研究中IgH基因重排与Ig蛋白重链表达模式未见统计学关联，说明二者作为检测肿瘤单克隆性的两个位点，相互独立。MALToma、FL、PC及试验组中两者联合检测肿瘤单克隆检出率分别升至96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)、94.0%(47/50)。3种肿瘤及试验组中联合检测阳性率均提高到90%及以上，MALToma阳性率达96.7%，因而Ig蛋白重链检测联合IgH基因重排检测可以提高肿瘤单克隆性的检出率。

Ig蛋白重链表达模式与预后相关参数的分析少见相关报道，而一些学者对于IgH基因重排与预后相关参数的关系做过一些分析。SHAN等[13]对21例原发性胃淋巴瘤的研究中，IE期IgH单克隆重排检出率为46.1%(6/13)，ⅡE期为100%(8/8)，其推测IgH单克隆重排检出率随临床分期的升高而升高。有学者对弥漫性大B细胞淋巴瘤骨髓及外周血的研究显示，IgH基因单克隆重排的阳性率随着临床分期及IPI的升高而升高，并与治疗后完全缓解率相关[14]。上述国外研究提示IgH基因单克隆重排与高级别临床分期、高的IPI及低治疗缓解率等预后不良因素相关。已知MALToma常见染色体易位包括t(11;18)(q21;q21)、t(1;14)(p22;q32)、t(14;18)(q32;q21)、t(3;14)(p14;q32)[15]，其中有3种涉及14号染色体的IgH基因，笔者推测IgH基因单克隆重排的病例可能同时伴随IgH基因的断裂、染色体异位，继而引起MALT1、Bcl-10、FOXP1等伴侣基因的激活，而引发肿瘤的预后不良。本研究发现MALToma中Ig蛋白重链表达模式、IgH基因单克隆重排与临床分期、危险度分型及PFS等预后因素均无关，两者联合检测与临床分期、危险度分型亦无关，与上述研究的差异可能与肿瘤类型不同、标本例数少及随访时间短等相关。

综上所述，单种Ig重链/全阴性Ig重链缺失表达的检出对上述3种肿瘤的诊断具有提示意义。Biomed-2引物系统在MALToma、FL、PC中IgH基因单克隆重排具有较高的检出率。两者联合检测可以提高肿瘤阳性检出率，对于以上3种肿瘤尤其是MALToma与RLH的鉴别诊断具有较高的临床病理应用价值。