葡萄籽原花青素对中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

李桂双 卜洁琼 龙剑文

过度的日光照射所引起的皮肤疾患和皮肤老化在皮肤科门诊中占据相当的比例[1,2]。紫外线(UV)辐射所导致的氧化应激损伤是引发皮肤光老化，光损伤的重要因素[3]，角质形成细胞是构成人表皮的主要细胞，而中波紫外线(UVB)主要作用于皮肤表皮，引起角质形成细胞氧化损伤和细胞凋亡[4]。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是从葡萄籽中提取的一类化合物，具有良好的清除自由基和抗氧化活性，以及广泛的细胞保护作用[5]。葡萄籽原花青素作为一种营养补剂已被广泛使用，目前证实其能有效清除机体内自由基，改善运动代谢、提高耐缺氧能力，具有抗疲劳、提高运动能力的功能[6]。但葡萄籽原花青素对紫外线引起的人角质形成细胞氧化损伤是否具有保护作用，目前还不清楚。因此，本文以HaCaT 细胞系为基础，观察了葡萄籽原花青素对UVB辐射诱导的人角质形成细胞氧化损伤的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 UVB辐照仪为德国Waldmann Medizintechnik公司生产，辐射波长为280～320 nm，工作强度为1.35 mW/cm2，采用TN2340紫外线强度检测仪(台湾泰纳)测量核实。葡萄籽原花青素(纯度≥95%)购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。HaCaT细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。0.25%胰酶、DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁化学公司。Hoechst 33258为美国Sigma公司产品。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)活力测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测试盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。活性氧簇(ROS)探针DCFH-DA购于北京索莱宝科技有限公司；Rhodamine 123为美国Invitrogen 公司产品。Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3抗体、辣根酶标记抗兔lgG抗体购于Cell signal technology公司。辣根酶标记的β-actin抗体为上海兴悠生物科技有限公司产品。ECL试剂盒为Amersham Biosciences公司产品。3111型细胞培养箱购于美国热电公司；BD FACSCanto II型流式细胞仪购于美国BD FACScan 公司。

1.2 试剂配制与实验分组 二甲基亚砜(DMSO)稀释制备葡萄籽原花青素工作溶液，DSMO终体积分数<0.1%，实验分为5组：正常对照组，UVB组，葡萄籽原花青素低浓度组(UVB+50 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素中浓度组(UVB+100 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素高浓度组(UVB+200 μg/mL GSPE)。

1.3 实验方法

1.3.1 各实验组处理方法 各组紫外线照射剂量为30 mJ/cm2[7]。将生长至80%融合的HaCaT细胞传代于细胞培养皿中，每组设立6个平行孔。葡萄籽原花青素各浓度组处理方法：UVB照射前，先将不同浓度的葡萄籽原花青素加入培养皿与对数生长期HaCaT细胞于培养箱中共同培养24 h，洗涤细胞，避光处打开平皿盖，并予以UVB辐射，加入新鲜培养液继续培养12 h，收集细胞或上清，检测相关项目；UVB组：取对数生长期HaCaT细胞于培养箱继续培养24 h，洗涤细胞，避光打开平皿盖，并予以UVB辐射，加入新鲜培养基，继续培养12 h，收集细胞或上清，检测相关项目；正常对照组：取对数生长期HaCaT细胞于培养箱正常培养对照。实验重复三次。

1.3.2 葡萄籽原花青素对HaCaT细胞增殖活力的影响 实验分为空白对照组，试验对照组(葡萄籽原花青素0 μg/mL剂量组)，试验组(葡萄籽原花青素50 μg/mL剂量组、葡萄籽原花青素100 μg/mL剂量组、葡萄籽原花青素200 μg/mL剂量组、葡萄籽原花青素400 μg/mL剂量组、葡萄籽原花青素800 μg/mL剂量组)。将生长至80%融合的HaCaT细胞传代于细胞培养皿中，每组设立6个平行孔，常规培养24 小时后，洗涤细胞，试验对照组和各试验组中加入CCK-8 10 μL，显色后，以各孔450 nm 波长的吸光值(Absorbance，A)显示细胞的存活数量。细胞的存活率(%)=[(A1-A3)/(A2-A3)]×100%。 A1～A3分别为试验组、试验对照组、空白对照组A值。实验重复三次。

1.3.3 LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量检测 各组HaCaT细胞处理后，收集各组细胞或上清，根据试剂盒说明书进行相关操作，分光光度计测量光密度值，根据说明书公式，计算各组LDH、SOD、GSH-Px和 MDA的活力或含量。

1.3.4 细胞凋亡检测 各组HaCaT细胞处理后，消化，洗涤，收集细胞，制备细胞悬液，冰浴避光中操作如下：采用结合缓冲液悬浮细胞，使其浓度为5×104/L，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h内，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。实验重复三次。

1.3.5 细胞凋亡形态的观察 制备HaCaT细胞悬液，调整密度为109个/L，接种于6孔培养板中。进行相关处理后，收集细胞并洗涤，4%多聚甲醛溶液固定后，PBS洗涤，Hoechst33258染色15 min。采用荧光显微镜观察细胞形态变化，并照相保存结果。实验重复三次。

1.3.6 葡萄籽原花青素对HaCaT细胞内ROS和线粒体膜电位水平的影响 各组HaCaT细胞处理后，消化，洗涤，收集细胞，制备细胞悬液。葡萄籽原花青素对HaCaT细胞内ROS水平的影响：各组加入ROS探针DCFH-DA 10 μmol/L，共同孵育60 min，PBS洗涤3次，消化，重悬细胞，流式细胞仪检测。将处理后细胞，荧光显微镜观察拍照。细胞内线粒体膜电位水平的检测：各组加入罗丹明123 1 mmol/L，共同培养30 min，重悬细胞，上机检测线粒体膜电位变化并记录。实验重复三次。

1.3.7 Western blotting检测蛋白表达 各组HaCaT细胞处理后，消化，洗涤，收集细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量检测，上样，采用SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，PBS洗膜，5%脱脂牛奶封闭l h；洗膜后加入一抗；4℃过夜；PBS洗膜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育0.5 h；洗膜；增强化学发光试剂盒处理。结果用Quantity one图像分析软件光密度分析，用各目的蛋白灰度值与β肌动蛋白灰度值的比值代表各检测蛋白的相对表达量。实验重复三次。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄籽原花青素对HaCaT细胞增殖活力的影响 与正常对照组比较(98.04±1.28)%，50 μg/mL GSPE组、100 μg/mL GSPE组、200 μg/mL GSPE组HaCaT细胞增殖活力无明显差异(存活率分别为(96.57±1.09)%、(96.54±1.46)%、(96.01±1.60)%，且四组组间比较差异无统计学意义(F=2.422，P=0.096)。而400 μg/mL GSPE组、800 μg/mL GSPE组，HaCaT细胞存活率分别为(91.00±3.65)%、(82.69±2.27)%，较正常对照组明显降低(F=58.570,P=0.000)。因此，选定葡萄籽原花青素的工作浓度为50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。

2.2 葡萄籽原花青素处理抑制了UVB辐射诱导的HaCaT细胞凋亡 在工作浓度范围内，葡萄籽原花青素对由UVB诱导的HaCaT细胞凋亡有明显抑制作用。比较正常对照组，在UVB组中，HaCaT细胞凋亡率显著增加(t=32.900,P=0.000)，说明UVB辐射能诱导HaCaT细胞凋亡。比较UVB组，在葡萄籽原花青素低浓度组、葡萄籽原花青素中浓度组、葡萄籽原花青素高浓度组中，HaCaT细胞凋亡率渐减少，且组间比较，差异有统计学意义(F=105.067,P=0.000)(图1a)。同时，Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下观察显示，存活HaCaT细胞胞核为椭圆形，显示为较暗的均一蓝色；而凋亡HaCaT细胞染色质凝聚，表现为亮蓝色(图1b)。图中结果表明，与正常对照组比较，UVB辐射后，凋亡细胞显著增加，而葡萄籽原花青素的处理抑制了UVB辐射诱导的细胞凋亡。

注：1：正常对照组，2：葡萄籽原花青素高浓度组，3：葡萄籽原花青素中浓度组，4：葡萄籽原花青素低浓度组，5：UVB组。#：对比UVB组，P<0.01，*：P<0.01

图1 葡萄籽原花青素抑制UVB辐射诱导的细胞凋亡(×400)

2.3 葡萄籽原花青素对UVB辐射条件下HaCaT细胞ROS水平的影响 DCFH-DA染色结果表明，与正常对照组比较(荧光强度为9.165±2.797)，UVB组ROS的荧光增强(荧光强度为93.39±6.051)。证实UVB辐射增强了HaCaT细胞内ROS水平(t=30.948,P=0.000)。经不同浓度葡萄籽原花青素处理后， HaCaT细胞内ROS荧光强度明显减弱(荧光强度为67.66±6.07、54.60±5.93、26.12±4.80)，提示葡萄籽原花青素处理能够显著抑制UVB辐射条件下ROS的生成(F=142.651,P=0.000)。

2.4 葡萄籽原花青素对UVB辐射条件下HaCaT细胞线粒体膜电位水平的影响 罗丹明123染色结果表明，与正常对照组比较(荧光强度为100.68±10.03)，UVB组 HaCaT细胞线粒体膜电位水平明显降低(荧光强度为19.03±3.93)。证实UVB辐射降低了HaCaT细胞线粒体膜电位(t=18.561,P=0.000)。经不同浓度葡萄籽原花青素处理后， HaCaT细胞线粒体膜电位荧光强度明显增强(荧光强度为35.49±5.61、61.52±7.68、78.92±6.60)，与UVB组比较,组间差异均有统计学意义(F=114.088,P=0.000)。

2.5 葡萄籽原花青素对UVB辐射条件下HaCaT细胞LDH，SOD，GSH-Px和MDA水平的影响 与正常对照组比较，UVB组中 HaCaT细胞中MDA水平，上清中LDH水平显著增高(t=14.528,P=0.000;t=20.535,P=0.000)，同时SOD，GSH-Px水平显著减少(t=18.829,P=0.000;t=11.394,P=0.000)。与UVB组比较，低，中，高剂量葡萄籽原花青素能够明显降低UVB辐射条件下HaCaT细胞中的MDA水平和上清中LDH水平(F=58.954,P=0.000;F=103.929,P=0.000)，且能够提高细胞中的SOD，GSH-Px含量(F=81.320,P=0.000;F=18.113,P=0.000)。

2.6 葡萄籽原花青素对UVB辐射条件下HaCaT细胞Bcl-2，Bax和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响 比较正常对照组，UVB组HaCaT细胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平显著增高(t=51.071,P=0.000;t=39.166,P=0.000)；比较UVB组，低，中，高剂量葡萄籽原花青素处理后，HaCaT细胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(F=246.836,P=0.000;F=368.861,P=0.000)。比较正常对照组，UVB组HaCaT细胞Bcl-2蛋白表达显著下降(t=26.585,P=0.000)；与UVB组比较，低，中，高剂量葡萄籽原花青素处理后，HaCaT细胞Bcl-2蛋白表达显著增高，差异有统计学意义(F=206.557,P=0.000)。

3 讨论

葡萄籽原花青素是由黄烷-3-醇或黄烷-3, 4二醇聚合而成的一类多酚化合物，具有特殊抗氧化活性[8]，在运动保健领域已得到广泛应用，它可以显著改善运动员免疫功能，提高运动成绩[9]，目前的研究表明原花青素对皮肤具有物理隔离紫外线的作用[10]，还具有美白等美容效果[11]，但具体机制研究并不深入。紫外线辐射对皮肤的损伤中，氧化损伤发挥重要作用，本文就原花青素对紫外线辐射所致的HaCaT细胞氧化损伤的保护作用进行了研究。

通过对葡萄籽原花青素不同浓度组对HaCaT细胞增殖活力的检测，结果表明，50 μg/mL GSPE组、 100 μg/mL GSPE组、 200 μg/mL GSPE组对HaCaT细胞增殖活力无明显影响。因此，葡萄籽原花青素的工作浓度采用50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL。30 mJ/cm2UVB照射后，HaCaT细胞凋亡率明显上升，说明UVB辐射能诱导角质形成细胞凋亡。结果与Salucci的报道一致[12]。进一步细胞内ROS和线粒体膜电位的检测表明，UVB辐射导致HaCaT细胞内ROS明显升高，和线粒体膜电位的下降。以前的研究表明过量的ROS可以损伤细胞线粒体，引起线粒体氧化还原状态失衡，导致线粒体膜电位水平下降，激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡[13]。Bcl-2和Bax是调节凋亡的上游信号，通过调控线粒体的通透性来调节细胞色素C的释放，Bcl-2抑制细胞色素C的释放，而Bax促进细胞色素C的释放。线粒体细胞色素C释放后能激活Caspase 9，进而激活Caspase 3，促进细胞凋亡[14]。为此，我们进一步检测了HaCaT细胞内Bcl-2，Bax，Cleaved caspase3的变化情况，结果证实，HaCaT细胞在受到UVB辐射后，Bax，Cleaved caspase3的水平明显上升，而Bcl-2水平则显著下降。在经过50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL葡萄籽原花青素处理后，比较UVB组，HaCaT细胞凋亡显著减少，细胞内ROS水平显著下降，而线粒体膜电位明显上升。同时，Bcl-2蛋白表达显著上升，Bax，活化Caspase3的水平明显下降。说明葡萄籽原花青素可以通过抑制UVB辐射导致的细胞内ROS过量产生，保护线粒体膜电位水平，进而抑制UVB辐射诱导的细胞凋亡。

为了阐明葡萄籽原花青素对UVB辐射导致的细胞氧化损伤的具体作用机制，我们又检测了细胞中SOD、GSH-Px、MDA，以及上清中LDH的水平，以往的研究表明MDA 是氧化应激的主要产物， 它们反映了细胞受自由基损伤的水平[15]，而SOD、GSH-Px具有显著的抗氧化功能[16]。30 mJ/cm2UVB辐射后，UVB组与正常对照组相比，MDA含量增高，而抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性显著下降。但HaCaT细胞经过不同浓度的葡萄籽原花青素处理后，细胞SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降，说明葡萄籽原花青素能促进抗氧化酶活性，减少氧化应激产物的产生。紫外线辐射产生的过量ROS使细胞膜的脂质双层结构氧化，通透性增加，细胞内LDH通过受损的细胞膜进入到上清中[17]，因此，上清中LDH的含量是细胞膜氧化损伤的重要标志，比较正常对照组，UVB组上清中LDH水平显著升高，而经过不同浓度葡萄籽原花青素处理后，上清中LDH水平显著下降，结果进一步证明，葡萄籽原花青素对UVB引起的细胞膜氧化损伤也具有明显保护作用。

综上所述，本研究证实了葡萄籽原花青素能拮抗中波紫外线诱导的角质形成细胞凋亡，其机制可能与葡萄籽原花青素能促进抗氧化酶的活性，减少ROS的产生，维持线粒体膜电位，抑制线粒体凋亡途径的活化有关。本研究为葡萄籽原花青素在皮肤科学中的进一步开发和应用提供了一定的依据。