转染CXCR4的MSCs对放射性肺损伤组织中细胞因子的影响

张春阳，祝 艳，冯华松

目前针对放射性肺损伤(RILI)，仍缺少有效的治疗手段。研究发现，间充质干细胞（MSCs）具有减轻放射性肺损伤、肺纤维化的作用[1]，且目前已开展临床试验研究探索[2]，但具体的作用机制仍不完全清楚。研究发现，通过提高MSCs上CXCR4基因的表达后，可增强其向受损伤组织部位的归巢，提升治疗效果[3]。前期研究中[4]，笔者已证实通过慢病毒转染，使来源于脐带的MSCs过表达CXCR4基因后，MSCs的趋化、迁移能力提高。目前国内尚无关于病毒转染CXCR4的MSCs对RILI中细胞因子影响的报道。本研究通过观察慢病毒转染CXCR4的MSCs对参与放射性肺损伤的10 kDa干扰素γ诱导蛋白（IP-10）、转化生长因子 β1（TGF-β1）、血小板源生长因子 (PDGF)、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)和基质金属蛋白酶（MMPs）-2的影响，探讨转染CXCR4的MSCs治疗RILI可能的机制，为MSCs在临床中的应用提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源与准备 新生儿脐带来源于医院妇产科，经医院伦理委员会批准，与产妇及家属签署知情同意书后，无菌条件下留取剖宫产的足月健康新生儿脐带，经组织块法贴壁培养[5]，实验采用第3代细胞。MSCs已进行多向分化和免疫表型鉴定[5]。通过慢病毒转染第3代MSCs，治疗组细胞采用携带 CXCR4和 EGFP的慢病毒载体（LV-CXCR4-EGFP），对照组细胞采用仅携带EGFP的慢病毒载体（LV-EGFP）进行转染，具体方法见参考文献[4]。

1.1.2 主要试剂及设备 CXCR4基因设定来源于人类，GENE ID为 7852，Genebank编号为 NM_001008540。CXCR4慢病毒载体，由上海吉凯基因化学技术有限公司协助构建，载体为GV287，分子量为 10.4 kb，元件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位点为AgeI/AgeI。C57雌性小鼠，购自军事医学科学院，动物合格证号：SCXK-（军）2012-0004。DMEM/F12培养基、青霉素、链霉素（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶（Trypsin）（Invitrogen 公司，美国），胎牛血清(FBS)（Gibco 公司，美国），羟脯胺酸（HYP）、丙二醛（MDA）ELISA试剂盒（华美生物有限公司），PDGF、TGF-β1 ELISA 试剂盒（Abcam 公司，美国），TNF-α ELISA试剂盒（Abcam公司，美国）。荧光倒置显微 镜 （Olympus 公司，CKX-41，日本），酶标仪（Thermo 公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 构建放射性肺损伤小鼠模型 将24只雌性出生后2个月左右的C57小鼠，随机分为4组：正常组、照射组、对照组和治疗组，每组各6只。照射组、对照组和治疗组小鼠腹腔注射5%水合氯醛（每只0.006 ml/g）麻醉后，呈俯卧位固定鼠板上。调整直线加速器照射野，设定照射参数(13 Gy，6 MV，3.68 Gy/min)，窗宽 20 cm×2.5 cm，源距 1 m，给予全肺一次性X线照射。照射之后，将小鼠放置动物房继续饲养。

1.2.2 各组干预措施 对照组和治疗组于放射线照射后第1 d，分别自小鼠尾静脉注射LV-EGFP和LV-CXCR4-EGFP转染后的MSCs，每只细胞数量5×105/0.2 ml。正常组和照射组，分别经尾静脉注射约0.2 ml的0.9%生理盐水。

1.3 荧光显微镜观察 放射线照射后的第7 d，处死小鼠后留取肺组织检测。取小鼠右肺下叶肺组织标本，进行冰冻切片，厚度5 μm；用含DAPI的甘油封片剂封片，荧光倒置显微镜下观察EGFP标记的MSCs在肺组织的分布情况。

1.4 病理组织学观察 左肺下叶标本进行石蜡包埋、切片，厚5 μm，行HE染色，光镜下观察病理组织学的变化。

1.5 ELISA检测 取小鼠右肺上叶标本，组织匀浆后，采用相应的ELISA试剂盒检测HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和 MMP-2 的含量。

1.6 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件分析数据，实验数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs在肺组织中分布 荧光显微镜观察发现，对照组和治疗组肺组织内有绿色荧光表达的细胞，且治疗组表达绿色荧光的细胞数量多于对照组；而照射组肺组织内未见明显的绿色荧光表达（图1）。

图1 荧光显微镜检测小鼠肺组织内EGFP标记的MSCs分布

2.2 病理组织学观察 HE染色可见，正常组肺组织肺泡壁完整，肺间质无增厚，无明显的炎性细胞渗出、浸润，结构组织清晰（图2a）；照射组肺组织可见肺泡间隔增厚，伴有大量炎性细胞浸润，部分肺泡腔逐渐变小，部分萎陷，肺泡正常结构破坏（图2b）；治疗组和对照组肺组织内，亦可见局部肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润，但肺泡间隔增厚程度明显较照射组减轻，肺泡组织结构破坏也较照射组明显减轻（图 2c、d）。

图2 小鼠肺组织病理组织学HE染色

2.3 ELISA检测结果 与正常组比较，照射组肺组 织 内 HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和MMP-2表达明显升高（P＜0.01），而治疗组和对照组较照射组明显下降（P＜0.01）。与对照组比较，除TNF外，治疗组其他指标下降的更加明显（P＜0.01）。见表1。

3 讨论

本研究发现，治疗组肺组织内EGFP标记的MSCs数量比对照组增多，提示转染CXCR4后MSCs归巢能力提高，与前期体外研究的结果相符合[4]。同时，组织病理学结果和反映组织氧化应激损伤的MDA和纤维化程度的HYP含量检测发现，转染CXCR4的MSCs较对照组MSCs，更明显地减轻放射线导致的氧化应激反应，并减少HYP的升高，提示其具有更好的减轻RILI作用。

RILI发生、发展过程中，涉及多种细胞因子和靶细胞相互作用，有促进和修复作用的细胞因子是影响 RILI发展趋势的主要因素[6]。IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMPs被认为具有参与损伤、介导炎症反应、促进纤维化形成的作用[6]。IP-10是属于CXC趋化因子家族的促炎细胞因子，在免疫系统不同的细胞系中起到诱导趋化性作用[7]，被认为参与介导RILI免疫反应[6]。TGF-β1是致纤维化细胞因子，被认为是放射性肺损伤重要的标志物之一[8]，给予输注MSCs后，可降低RILI小鼠体内TGF-β1的水平[9]。PDGF具有趋化炎症细胞、成纤维细胞的作用，使肺内成纤维细胞分裂和增殖增加，促进纤维化的形成[10]。TNF-α是促炎性反应的细胞因子[10]，在RILI的发生和维持过程中具有重要作用。MSCs通过拮抗TNF-α阻断纤维化信号通路[11]。研究发现[12]，肺纤维化早期阶段，MMPs的水平升高，降解细胞外基质的作用增强，从而损伤肺组织。本研究发现，上述细胞因子在放射线照射后小鼠肺组织内表达均明显升高，与文献报道相一致。而在给予MSCs后，其表达水平均显著下降，其中转染CXCR4的MSCs相对于对照组，其抑制作用更加明显，提示转染CXCR4的MSCs具有更好的抑制放射线照射致细胞因子异常表达作用，从而减轻RILI。这有可能与提升MSCs趋化归巢能力后，使进入局部损伤组织的MSCs增多有关，但不能排除局部由于过表达CXCR4后，影响了RILI组织内其他的信号通路机制导致有关，还需要进一步研究明确。

表1 各组ELISA检测结果比较(n=6)

综上所述，通过输注转染CXCR4的MSCs可更好地减轻RILI，更有效地抑制参与RILI细胞因子的异常升高，为今后利用基因修饰的MSCs治疗RILI提供有力的理论依据。