褪黑素对miRNA-223表达的影响及对脓毒症小鼠心肌损伤保护作用的机制

刘铭传，李林成，曹梦远，张家宁，刘 洋，何 亭

脓毒症及脓毒症休克是危重症领域的重大难题，病死率为25%～30%,合并休克的患者病死率更高，为40%～50%[1]。2016年脓毒症与脓毒性休克处理国际指南定义“脓毒症3.0”：针对感染的失调的宿主反应引起的危及生命的器官功能障碍[2]。多项研究表明，褪黑素具有延缓衰老、抗击肿瘤、抗炎、抗氧化、改善睡眠、调节免疫等作用，可能有助于改善脓毒症的器官损伤[3-6]。MicroRNAs是一类具有基因表达调控功能的非编码RNA[7]。研究显示，MicroRNAs在炎性反应中起着关键作用，被证实是潜在的脓毒症生物标志物[8]，而miRNA-223是其中之一。本研究拟通过观察褪黑素对脓毒症小鼠miRNA-223及炎性因子和心肌损伤的影响，来初步判断褪黑素和miRNA-223的关系及其对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用。

1 实验材料与方法

1.1动物、主要试剂及仪器来源 健康清洁级雄性C57BL/6小鼠[许可证号：SYXK(军)2012-0022]48只，鼠龄6～8周，重量18～20 g，购自空军军医大学实验动物中心。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6均从南京建成生物工程研究所购买。Bcl-2、Bax多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗小鼠β肌动蛋白抗体(美国Cell Signal公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、二抗山羊抗鼠IgG二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，SYBR Green MasterMix(美国ABI公司)，内毒素(Sigma公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，氯仿，异丙醇，乙醇，DEPC处理水等均为国产分析纯。3-18K型高速冷冻离心机(Sigma公司)，7900HT型荧光定量PCR仪(美国应用生物公司)，ImageMaster凝胶成像分析仪(Applied Biosystems公司)。紫外线分光光度计、mini PROTEAN型垂直电泳仪、电转移仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2动物分组及脓毒症模型制备 小鼠实验前分笼饲养24 h，自由饮食，按随机数字表法分为3组，每组16只。生理盐水组、褪黑素治疗组给予内毒素10 mg/kg一次性腹腔给药制备脓毒症模型，假伤组于腹腔内注射等体积生理盐水。

1.3动物给药处理 褪黑素治疗组于建模前30 min、建模时、伤后4 h分3次注射褪黑素(30 mg/kg)，生理盐水组和假伤组均在褪黑素治疗组相应给药时间点注射等量生理盐水。3组小鼠处理后分笼饲养，自由饮食。

1.4血清及脏器标本采集 3组各取8只小鼠在处理24 h后，通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，眼球采血1 ml。室温静置15 min后，12 000 r/min条件下离心15 min后收集上层血清，分装在Eppendorf管中，置于-80℃条件下保存。其余小鼠在处理48 h后提取心肌组织：麻醉后采用颈部脱臼法处死小鼠，并立即剪取心肌组织，用4℃冰生理盐水冲洗干净，其中一部分用多聚甲醛固定，其余部分置于-80℃下冻存。

1.5检测指标

1.5.1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-1β、IL-6含量：取出-80℃冰箱血清标本，按照IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒操作说明，已知抗体稀释缓冲液包被，4℃过夜，洗涤，设立空白孔，每孔加待测血清，37℃孵育1 h，洗涤，各孔加酶标抗体，温育，洗涤，加底物液显色，终止反应，空白孔调零，利用酶标仪450 nm波长测各孔吸光度(OD)值，绘制标准曲线，计算血清IL-1β、IL-6表达水平。

1.5.2蛋白免疫印迹法检测心肌组织中凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白表达：取出-80℃下冻存的心肌组织，加入裂解液后，吹打并转移至Eppendorf管中，对提取蛋白进行定量。加入上样缓冲液后，100℃高温变性10 min。用10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，4℃电转膜100 min。使用5% TBST脱脂奶粉洗膜，共洗3次，每次5 min。然后加入抗Bcl-2抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司，1∶1000)，抗Bax抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司，1∶1000)。4℃过夜，再用TBST洗掉一抗，加入山羊抗兔特异性二抗(HRP标记的二抗1∶3000)，37℃条件下孵育1 h。TBST洗去二抗，共洗3次，每次5 min。加入化学发光液，用ImageMaster凝胶成像分析仪成像及扫描分析，目的蛋白表达水平按照与β-actin灰度比值来表示。实验重复3次。

1.5.3心脏组织切片HE染色观察组织形态：取出多聚甲醛固定的各组心脏组织，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋切片，经HE染色，在低倍镜下观察3组小鼠心肌组织的病理变化情况。

1.5.4实时荧光定量PCR法检测心肌组织中miRNA-223含量：取出-80℃下冻存的心肌组织，按照组织与生理盐水1∶9制成组织匀浆，3000 r/min离心15 min，取上清液，按照1∶1加入1 ml Trizol试剂，按说明书要求提取RNA，且反转录出cDNA。反应结束后，将制得的cDNA行PCR扩增，以U6为内参，扩增条件为：95℃预变性 10 min，95℃变性10 s，60℃退火延伸20 s，循环40次，每个循环结束后检测荧光信号，测定结果按照2-△△Ct相对定量方法计算。每个标本设置3个复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1血清IL-1β、IL-6水平 3组血清IL-1β、IL-6水平比较差异有统计学意义(P<0.01)；生理盐水组和褪黑素治疗组血清IL-1β、IL-6水平高于假伤组,但褪黑素治疗组低于生理盐水组(P<0.01)。见表1。

2.2心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平 3组心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。生理盐水组、褪黑素治疗组心肌组织中Bcl-2表达水平低于假伤组，而褪黑素治疗组高于生理盐水组(P<0.01);生理盐水组、褪黑素治疗组心肌组织中Bax蛋白表达水平高于假伤组，褪黑素治疗组低于生理盐水组(P<0.01)。见图1、表2。

表1 3组小鼠血清白介素-1β和白介素-6水平比较

注：与假伤组比较，bP<0.01;与生理盐水组比较，dP<0.01

图13组小鼠伤后24h心肌组织中凋亡相关分子Bcl-2、Bax蛋白表达

表2 3组小鼠伤后24 h心肌组织中凋亡相关分子Bcl-2、Bax蛋白表达

注：与假伤组比较，bP<0.01;与生理盐水组比较，dP<0.01

2.3小鼠心肌组织病理变化 假伤组心肌纤维排列整齐，界限清楚，细胞核清晰，核膜完整，无炎性细胞浸润；生理盐水组心肌纤维明显肿胀，排列不齐，可见有胞核破碎，胞质嗜酸性增强，凋亡细胞体积缩小，间质内大量炎性细胞浸润；褪黑素治疗组损伤程度有所减轻，心肌纤维稍肿胀，排列较整齐，有少量炎性细胞浸润。见图2。

图2 3组小鼠伤后48 h心肌组织病理检查结果(HE×200)

2.4心肌组织miRNA-223表达水平 假伤组、生理盐水组和褪黑素治疗组小鼠心肌组织miRNA-223表达水平分别为0.97±0.15、0.29±0.10、0.66±0.10，3组比较差异有统计学意义(P<0.01)。褪黑素治疗组及生理盐水组心肌组织miRNA-223表达水平均低于假伤组，褪黑素治疗组高于生理盐水组(P<0.01)。

3 讨论

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征[9]，严重者出现脓毒症休克，甚至导致多器官功能障碍(MODS)，而心功能衰竭是脓毒症的主要表现之一，一旦脓毒症合并心肌损伤，患者病死率将明显升高[10-11]。脓毒症损伤心肌引起心肌功能障碍，主要表现为心室扩张、左心室射血分数下降以及收缩峰值压力/收缩末期容积比值下降等[12]，其发病机制复杂，涉及失控性炎性反应、氧化应激以及免疫功能紊乱等多个方面[13]，而过度炎性反应介导的组织损伤是公认的重要发病机制之一。有研究显示，脓毒症感染通过Toll样受体、核因子-κB(NF-κB)以及p38-MAPK等信号通路产生大量炎性因子损伤心肌，严重者引起心功能衰竭[14-15]。本研究结果显示，生理盐水组、褪黑素治疗组心肌组织IL-1β、IL-6水平均高于假伤组，提示内毒素导致炎性反应明显增强，小鼠脓毒症模型制备成功。

脓毒症的治疗是医疗领域的重大难题，而褪黑素是近年发现的有效药物之一，其不仅能够调节睡眠，同时具有强大的抗炎和抗氧化作用[16-17]，褪黑素抗炎和抗氧化对脓毒症和多器官功能衰竭的保护具有重要作用[18]。而褪黑素抗炎的作用机制目前还不是很清楚，有研究显示，褪黑素抑制脓毒症NF-κB/NLRP3炎性小体通路，从而抑制促炎症蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)活化切割IL-1β和IL-18的前体，减轻脓毒症的炎性损伤[19]。本研究结果显示，褪黑素治疗组血清中IL-1β、IL-6水平低于生理盐水组。提示褪黑素可以降低引起细胞损伤的促炎因子IL-1β、IL-6的表达，这与Rahim等[19]研究结果一致。通过对小鼠心肌损伤的病理变化观察，发现生理盐水组小鼠心肌细胞出现严重凋亡损伤，而褪黑素治疗组心肌功能障碍改善明显。提示内毒素能够诱导过度的炎性反应从而导致心肌组织凋亡损伤，而褪黑素可能通过减轻炎性反应水平进而减轻器官功能损伤。除此之外，我们通过测定凋亡相关因子Bcl-2、Bax发现，褪黑素治疗组Bcl-2表达水平高于生理盐水组，而Bax表达水平低于生理盐水组。与心肌组织的病理损伤相一致，更加证实褪黑素可以减轻炎性反应，从而抑制心肌细胞凋亡，起到减轻心肌损伤的作用。

近年研究表明，多种miRNA分子如miRNA-125b、miRNA-200b、miRNA-203和miRNA-155等，通过抑制Myd88和TLR调控TLR/Myd88/NF-κB信号通路，参与调控炎性反应的过程[20]。miRNA是一种通过结合mRNA 3'端的短核心序列转录后调控mRNA[21]。RNA聚合酶Ⅱ转录miRNA基因，产生大小为70～100个核苷酸的具有发夹结构的前体miRNA，经Dicer酶加工后产生miRNA[22]。Real等[23]研究发现，脓毒性休克患者的外泌体表达与炎症和细胞周期调节有关的miRNA，可能成为脓毒症潜在的治疗靶点和生物标志物[24]。而miRNA-223是我们本次研究的重点。近年来有研究证实，miRNA-223可以负性调控许多炎性因子如NLRP3、STAT3以及IL-6的表达等减轻炎性反应，保护组织功能[25-26]。而褪黑素抗炎途径是否是通过调控miRNA来实现，我们进行了初步的研究。生理盐水组miRNA-223表达量低于假伤组，而褪黑素治疗组高于生理盐水组,提示miRNA-223很可能是褪黑素的作用靶点，炎性因子IL-1β、IL-6等可能受到miRNA-223的调控。大量研究也证明miRNA-223可以有效抑制炎性因子如IL-1β、IL-6等的表达[27-28]。Zhang等[29]发现褪黑素可以通过miRNA-223来抑制动脉粥样硬化过程中内皮细胞的炎性反应。当然，关于揭示褪黑素和miRNA-223关系的文献报道还比较少。本实验我们仅证明了褪黑素治疗脓毒症与miRNA-223有一定的相关性，推测miRNA-223可能为褪黑素抑制炎性反应的作用靶点。为进一步研究miRNA-223在褪黑素治疗脓毒症中的重要作用，我们将通过观察不同浓度褪黑素对miRNA-223表达水平的影响以及通过转染增强miRNA-223或者敲除miRNA-223，来进一步明确miRNA-223是否是褪黑素抑制炎性反应，减轻心肌损伤的重要分子。

综上所述，褪黑素能明显减轻脓毒症小鼠心肌损伤，其作用机制可能是通过上调miRNA-223表达，抑制IL-1β、IL-6等炎性因子表达发挥抗炎、保护心肌组织的作用，但是尚待进一步证实。