羽扇豆醇对脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤和炎性反应的调节作用及机制研究

侯 辰，唐 鹏，刘 玥，张 欣，陈 丽，张李娜

脑缺血再灌注(IR)损伤是一种严重的临床问题，其原因包括心脏骤停、周围血管功能不全和卒中[1]。损伤机制在缺血期间被触发，在再灌注期间加重[2]。IR的损伤机制包括氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能损伤[3]。在缺血过程中，细胞膜改变导致钙超载，从而激活细胞内钙依赖的级联反应，诱导促炎细胞因子，抑制抗炎细胞因子，并且促进次黄嘌呤和自由基的产生。在再灌注后期，过量的氧与次黄嘌呤发生反应，导致多种有毒过氧化物的形成。这些强效氧化剂会导致DNA损伤，以及蛋白质氧化，并通过脂质过氧化直接损伤细胞膜[4]。因此IR损伤过程中，氧化应激反应和炎性反应是最重要的病理过程[5]。羽扇豆醇是一种三萜类天然产物，几种常见的果蔬中都含有羽扇豆醇，如草莓、卷心菜、芒果、葡萄、青椒和橄榄等[6]。研究表明，羽扇豆醇对炎症、癌症、关节炎、糖尿病、心脏病、肾毒性和肝毒性都有改善的作用[7]。本研究旨在探讨羽扇豆醇对IR大鼠氧化应激损伤和炎性反应的调节作用和机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及主要试剂 120只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠来源于中国科学院实验动物中心，体重250～280 g。动物被安置在特定的无菌环境中：温度22℃左右，相对湿度55%～60%，12 h昼夜交替，大鼠能自由获取食物和饮用水。Tunel试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)购自罗氏(Roche)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R&D公司。抗Bcl-2(ab196495)和Bax(ab32503)抗体购自Abcam公司。苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自Solarbio公司，货号：G1120。

1.2动物分组及模型制备 120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、不同浓度羽扇豆醇组。模型组和不同浓度组采用改良线栓法制备大鼠IR损伤模型：用2%异氟醚麻醉大鼠，用尼龙线结扎大鼠颈总动脉，线栓向上推行至大脑中动脉，造成大脑中动脉梗阻，缺血2 h后，拔退线栓，恢复大脑供血，缝合消毒，待大鼠醒后，按Longa标准筛选IR模型[8]，符合评分标准的模型进入后续实验。假手术组：大鼠麻醉后进行开刀和缝合手术，不进行动脉结扎。不同浓度羽扇豆醇组分别给予羽扇豆醇10、20、50 mg/kg腹腔注射，模型组和假手术组均给予相同浓度的DMSO生理盐水腹腔注射。

1.3标本采集 5组大鼠连续注射1周药物或溶剂后收集血清待测，颈椎脱臼法处死，取脑组织制成石蜡切片(固定-脱水-包埋-切片)用于后续切片染色；并收集各组脑组织液氮冷冻，-80℃冰箱冷藏待检测。

1.4HE染色 将5组大鼠脑组织石蜡切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；给予HE染色，在显微镜下观察组织病变情况并拍照。

1.5TUNEL染色 二甲苯脱蜡，每次5 min；梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)复水，每次3 min；在25℃条件下，Proteinase K工作液消化组织15 min；PBS漂洗；按照说明书进行TUNEL染色，漂洗；玻片干后加50 μl converter-POD于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃条件下反应30 min，漂洗；在组织处加50 μl DAB底物，在25℃条件下反应10 min，漂洗；拍照，然后用苏木素复染3～5 s，立即用自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。加一滴PBS在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞并拍照。

1.6蛋白免疫印迹法检测脑组织线粒体损伤标记蛋白表达水平 液氮研磨脑组织，提取组织中总蛋白；取等量蛋白与适量Loading buffer混合，100℃金属浴10 min；上样到SDS-PAGE凝胶电泳中分离蛋白，并转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1～2 h；加入抗Bax和抗Bcl-2一抗，4℃过夜孵育，次日，TBST清洗后再加标记HRP的二抗，室温孵育1 h，清洗。最后加入发光液，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用ImageJ软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH作为上样量一致的参照，至少进行3个独立的重复实验。

1.7ELISA检测血清中氧化应激标志物水平和血清炎性因子水平 取5组大鼠血清，检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平和白介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。按照说明书，加入稀释好的标准品50 μl于反应孔，加入待测样品50 μl于反应孔内，设计好复孔和阴性对照；立即加入50 μl的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1 h；甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作4次；每孔加入80 μl的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min，洗涤方法同上；每孔加入底物A、B各50 μl，轻轻振荡混匀，37℃避光温育10 min；取出酶标板，迅速加入50 μl终止液，加入终止液后应立即测定结果：在450 nm波长处测定各孔的吸光度(OD)值。

2 结果

2.1IR损伤改善情况 模型组相较于假手术组病理改变非常明显，提示大鼠模型制备成功；与模型组比较，不同浓度羽扇豆醇组脑组织损伤程度随加药浓度增加而明显减轻，脑组织间隙的空泡变少，并且出现核边集、固缩的神经元也明显减少。见图1。

2.2脑组织细胞凋亡率 与假手术组比较，模型组细胞形态特征呈现出未染色细胞变小，胞膜完整，出现空泡；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状；不同浓度羽扇豆醇组细胞形态随药物浓度增加逐渐趋近于假手术组。见图2。假手术组、模型组、羽扇豆醇10 mg/kg组、羽扇豆醇20 mg/kg组和羽扇豆醇50 mg/kg组细胞凋亡率分别为(5.1±0.5)%、(58.2±8.1)%、(39.3±8.9)%、(24.2±7.1)%、(13.3±5.2)%。模型组细胞凋亡率高于假手术组(P<0.01)；不同浓度羽扇豆醇组细胞凋亡率低于模型组，且呈剂量依赖性(P<0.01)。

图1 5组大鼠脑组织病理变化情况(HE×400)

图2 5组大鼠脑组织细胞凋亡情况(TUNNEL×400)

2.3线粒体损伤标记蛋白表达情况 与假手术组比较，模型组Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较，不同浓度羽扇豆醇组Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.01)。见图3、表1。

图3 5组大鼠脑组织线粒体损伤标记蛋白表达水平

组别鼠数Bcl-2Bax假手术组241.40±0.100.12±0.05模型组240.15±0.01b1.60±0.13b羽扇豆醇10 mg/kg组240.30±0.06d1.20±0.14d羽扇豆醇20 mg/kg组240.64±0.07df0.40±0.07df羽扇豆醇50 mg/kg组241.15±0.10dfh0.20±0.05dfh

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01；与羽扇豆醇10 mg/kg组比较，fP<0.01；与羽扇豆醇20 mg/kg组比较，hP<0.01

2.4氧化应激损伤情况 与假手术组比较，模型组血清中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.01)。与模型组比较，不同浓度羽扇豆醇组血清中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.01)。见表2。

表2 5组大鼠血清氧化应激标志物水平变化情况

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01；与羽扇豆醇10 mg/kg组比较，fP<0.01；与羽扇豆醇20 mg/kg组比较，hP<0.01

2.5炎性反应 与假手术组比较，模型组IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型组比较，不同浓度羽扇豆醇组IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.01)。见表3。

表3 5组大鼠血清炎性因子水平变化情况

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01；与羽扇豆醇10 mg/kg组比较，fP<0.01；与羽扇豆醇20 mg/kg组比较，hP<0.01

3 讨论

IR损伤过程中常伴随缺血脑组织神经元细胞凋亡，这是通过激活caspase依赖性凋亡信号通路介导的[3，9]。Bax加速细胞凋亡过程，而Bcl-2抑制细胞凋亡。Bax/Bcl-2平衡失调会造成线粒体损伤[10]。在缺血区域，Bax水平升高，而Bcl-2水平下降，导致线粒体中细胞色素C的释放，从而引发脑缺血后细胞凋亡[11]。本研究结果显示，模型组脑组织细胞凋亡率高于假手术组，且Bax水平升高，Bcl-2水平下降，与上述文献报道结果一致。用不同浓度羽扇豆醇处理后，Bax水平随药物浓度增加而降低，Bcl-2水平随药物浓度增加而升高。提示羽扇豆醇能降低大鼠IR损伤模型细胞凋亡，减少线粒体损伤。

有大量的证据证明氧化应激在缺血再灌注诱导的大脑氧化应激的发病机制中的作用[5,12]。活性氧和脂质过氧化物在氧化应激损伤中起关键作用[13-14]。机体在对抗氧化应激时，SOD、GSH能抵消部分过氧化物，局部缺血时，这些物质几乎消耗殆尽；而脂质过氧化产物MDA水平则大幅提高。羽扇豆醇的抗氧化应激能力早有报道。Sunitha等[15]发现羽扇豆醇通过清除自由基提高大鼠肝脏的抗氧化作用，从而改变镉暴露诱导的组织氧化还原系统的影响。Prasad等[16]发现补充羽扇豆醇可以有效地降低肝脏二甲丁醇酸诱导的氧化应激，恢复抗氧化酶活性，降低脂质过氧化作用。Yamashita等[17]研究表明，Lupeol能抑制fMLP处理的人中性粒细胞中花生四烯酸诱导的过氧化物。Lupeol已被证明可以抑制活性氧生成，并能恢复在雄激素预处理小鼠的前列腺组织中衰竭的抗氧化水平[18]。本研究结果显示，模型组SOD和GSH水平低于假手术组，MDA水平高于假手术组；用不同浓度羽扇豆醇处理后，血清SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，与上述研究结果一致。提示羽扇豆醇能增加抗氧化物酶活性，有效减少氧化应激损伤。

近年来，大量研究表明炎性反应在IR损伤中起着关键作用[19-20]。大量炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)参与IR损伤后的脑细胞凋亡和坏死[21]，及脑缺血引起的炎性反应[22]。有研究报道，减少炎性因子可以保护大脑不受IR的影响[23]。研究发现，羽扇豆醇的抗炎作用相当于地塞米松[24]，可以通过抑制IL-1β、IL-6和TNF-α达到抗炎的效果[25]。Fernández等[2]研究表明，对耳鼠局部给药可以减轻TPA诱导的炎性反应，羽扇豆醇局部应用可降低髓过氧化物酶(中性粒细胞特异性标记)水平，从而减少小鼠细胞向炎性组织浸润，可减少脂多糖处理的巨噬细胞中TNF-α和IL-β等促炎性因子的生成。有研究在支气管哮喘小鼠模型中，观察到羽扇豆醇通过降低Ⅱ型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平而缓解炎症[24]，还可促进M1巨噬细胞转化为M2，并改善实验性炎症性肠病[26]。本研究结果表明，与假手术组比较，模型组炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)显著增加，与模型组相比，不同浓度羽扇豆醇组IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，与上述研究结果一致。提示羽扇豆醇能减少促炎性细胞因子，降低IR炎性反应。

综上所述，羽扇豆醇可抑制IR损伤引起的细胞凋亡，降低IR氧化应激损伤和炎性反应。已知文献报道了其他药物通过激活JAK-STAT减少细胞凋亡，改善IR损伤[27]，以后可以检测相关通路蛋白表达水平，进一步探索羽扇豆醇改善IR损伤分子机制。