沉默纤维介素2基因表达对急性坏死性胰腺炎小鼠的治疗作用

邵利梅 叶晓华 丁进

纤维介素2(fibrinogen-like protein 2, FGL2)为纤维蛋白原超家族成员，在体内存在两种形式，即膜型FGL2(mFGL2)和分泌型FGL2(sFGL2)，mFGL2具有凝血酶原酶活性，可通过介导各脏器内微血栓的形成引起器官损伤，sFGL2是T细胞的效应分子，发挥免疫调节活性，防止组织损伤[1]。Xi等[2]报道，沉默MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠的FGL2基因表达可减轻肝细胞的坏死和凋亡。叶晓华[3]报道，急性坏死性胰腺炎(acute necrotic pancreatitis, ANP)大鼠胰腺组织FGL2 表达升高，且与细胞凋亡密切相关。故本研究构建携带靶向FGL2的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的腺病毒(Ad-FGL2-siRNA) ，探讨FGL2在ANP小鼠胰腺细胞凋亡中的作用及机制。

材料与方法

一、材料及试剂

健康SPF级雄性C57/BL小鼠由上海实验动物研究中心提供。饲养在安静、恒温恒湿、12 h自然光照与黑暗交替、食水持续供给的环境中，所有操作均遵守浙江大学金华医院动物保护条例。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司，ELISA试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司，SYBR Green Master Mix购自美国Life technologies公司，FGL2抗体购自美国Santa Cruz公司，EnVision试剂盒购自丹麦Dako公司，TUNEL凋亡试剂盒购自瑞士Roche公司。

二、动物分组及模型制备

实验前动物禁食12 h，不禁水。采用腹腔内注射10%水合氯醛(2 ml/kg体重)麻醉，将小鼠分为对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组，每组6只。对照组开腹轻翻动胰腺组织后关腹；ANP组采用胰胆管逆行注射4%牛磺胆酸钠溶液(1 ml/kg体重)方法诱导ANP模型；Ad-FGL2-siRNA组在造模前经尾静脉注射0.5 ml 4×108pfu/ml的Ad-FGL2-siRNA。对照组及ANP组经尾静脉注射等剂量不携带Ad-FGL2-siRNA的腺病毒。术后6 h处死小鼠，抽取下腔静脉血0.5 ml，分离血清，置-20℃冰箱保存；取胰腺组织标本，部分置于4%多聚甲醛保存，部分经液氮速冻后置-80C°冰箱保存。

Ad-FGL2-siRNA由上海锐赛生物科技有限公司设计并构建。靶向FGL2的siRNA正向序列为5′-TGCTGTTCTTTGAGCACCTCCTCCATGTTTTGGCCA-CTGACTGACATGGAGGATGCTCAAAGAA-3′，反向序列为5′-CCTGTTCTTTGAGCATCCTCCATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATGGAGGAGGTGCTCAAAGAAC-3′。

三、胰腺组织病理学检查

取固定的胰腺组织常规行病理学检查。光镜下随机选取10个视野，根据Schmidt等[4]的标准对胰腺损伤的水肿、出血、腺泡细胞变性和间质炎症进行评分。

四、血清TNF-α和IL-1β水平检测

采用ELISA法测定血清TNF-α和IL-1β水平，按试剂盒说明书操作。根据标准品的A450值绘制标准曲线，获取二元方程式，计算待测标本的TNF-α和IL-1β水平。

五、胰腺组织FGL2 mRNA及蛋白表达检测

应用Trizol法提取胰腺组织RNA，反转录成cDNA后应用美国ABI 7500型实时荧光定量PCR仪进行扩增。FGL2正义引物序列为5′-TGCCTTGCGTTTCAGTCG-3′，反义引物序列为5′-AATCCCATTACGGACACCTTT-3′。内参β-actin正义引物序列为5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3′，反义引物序列为5′-TCATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′。每个样本做3个复孔，以双蒸水代替cDNA模板作为空白对照。应用公式2-ΔΔCt计算FGL2 mRNA表达量。

应用RIPA裂解液提取速冻胰腺组织的总蛋白，使用BCA法定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测FGL2蛋白，以β-actin作为内参。FGL2一抗工作浓度1∶200，最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。采用Image J软件进行条带扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

同时，取固定的胰腺组织，常规制备切片，采用免疫组织化学法检测FGL2蛋白表达，以BSA代替一抗作为对照，依据EnVision试剂盒说明书操作。FGL2一抗工作浓度1∶50，辣根过氧化物酶标记的二抗工作浓度1∶1 000，最后DAB 显色剂显色，苏木素复染。以胞质染为淡黄色至棕褐色为阳性细胞标志，主要浸润于微血管的内皮细胞和间质组织。在200倍光镜下随机选取10个不同视野，阳性细胞率为阳性细胞数/总细胞数×100%，取均值。

六、胰腺组织细胞凋亡检测

采用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynu-cleotidyl transferase，TdT)介导dUTP缺口末端标记法检测胰腺组织细胞凋亡，按试剂盒说明书操作。用标准的荧光过滤装置在(520±20)nm的荧光下观察，绿色荧光为凋亡细胞，镜下计数凋亡细胞。

七、统计学处理

结 果

一、各组小鼠胰腺组织的病理学改变

对照组胰腺组织学形态保持正常，ANP组的胰腺组织表现为水肿、出血、腺泡欠完整和炎症细胞浸润，Ad-FGL2-siRNA组胰腺组织的病理损伤较ANP组明显减轻(图1)。对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组小鼠胰腺组织的病理评分分别为(1.33±0.21)、(9.17±0.98)、(6.26±0.52)分，ANP组较对照组显著升高，Ad-FGL2-siRNA组较ANP组显著下降，但仍显著高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

二、各组小鼠血清 TNF-α、IL-1β水平变化

对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组小鼠血清TNF-α 水平分别为(63.8±4.2)、(240.4±18.6)、(123.0±10.3)ng/L；IL-1β水平分别为(43.6±4.4)、(186.6±18.7)、(92.0±10.9)ng/L。ANP组较对照组显著增高，Ad-FGL2-siRNA组较ANP组显著下降，但仍显著高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

图1 对照组(1A)、ANP组(1B)、Ad-FGL2-siRNA组(1C)小鼠胰腺组织病理学改变(HE ×200)

三、各组小鼠胰腺组织FGL2mRNA及蛋白表达变化

对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组小鼠胰腺组织FGL2 mRNA相对表达量分别为1.20±0.22、4.40±1.21、2.15±0.56，ANP组较对照组显著增高，Ad-FGL2-siRNA组较ANP组显著下降，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而Ad-FGL2-siRNA组FGL2 mRNA表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义。

对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组小鼠胰腺组织FGL2蛋白相对表达量分别为0.33±0.08、1.23±0.24、0.68±0.09(图2)，FGL2阳性细胞率为(2.56±0.31)%、(15.10±3.23)%、(8.68±1.81)%(图3)，ANP组均较对照组显著增加，Ad-FGL2-siRNA组均较ANP组显著减少，但仍显著高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

四、各组小鼠胰腺组织细胞凋亡数

对照组、ANP组、Ad-FGL2-siRNA组小鼠胰腺组织内细胞凋亡数分别为(4.51±1.21)、(35.81±4.11)、(11.79±3.02)个/200倍视野，ANP组、Ad-FGL2-siRNA组显著多于对照组，Ad-FGL2-siRNA组又较ANP组显著减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

图2 对照组(1)、ANP组(2)、Ad-FGL2-siRNA组(3)FGL2蛋白表达(蛋白质印迹法)

图3 对照组(3A)、ANP组(3B)、Ad-FGL2-siRNA组(3C)FGL2蛋白表达(免疫组织化学染色 ×200)

讨 论

ANP早期很多因素可引起胰腺腺泡细胞的损伤或死亡，腺泡细胞坏死会提高胰腺细胞内的胰蛋白酶活性，释放多种炎症因子，激活炎症级联反应，而坏死-凋亡转变机制在病情的严重程度方面起了极大的作用[5-7]。针对重症急性胰腺炎(SAP)的免疫细胞的成熟、凋亡、分化等进行调控，是近几年来ANP治疗领域的方向之一[8]。FGL2属于纤维蛋白原家族，由活化的巨噬细胞和内皮细胞表达，能催化凝血酶原转化为凝血酶，启动凝血过程。FGL2可参与ANP大鼠微血栓形成，促进了SAP的发生与发展[3,9]。本课题组既往的研究表明，FGL2在ANP动物模型及SAP患者外周血高表达，引起ANP相关性肝损伤的肝细胞微血栓形成[10]，并与一些其他疾病的细胞凋亡密切相关。腺病毒介导的微小RNA靶向调节mfgl2、mFas和mTNFR1，能明显改善爆发性肝衰竭的肝细胞坏死和凋亡[2]；进一步研究表明IL-33通过靶向FGL2保护重症病毒性肝炎小鼠[11]；此外，沉默FGL2也可抑制心肌细胞的凋亡，改善糖尿病大鼠的心功能[12]。但FGL2对ANP细胞凋亡及疾病进展的作用尚不清楚。

复制缺陷型腺病毒是最先进、研究最好的载体系统之一，可高水平表达外源基因[13]，既往实验表明Ad-FGL2-siRNA对体外靶基因有明确的抑制作用[2]。本研究首次在ANP小鼠模型中通过Ad-FGL2-siRNA沉默FGL2基因来研究其作用，结果表明，FGL2基因沉默可显著缓解ANP的胰腺病理学损伤，减少胰腺组织的水肿、出血、腺泡破坏和炎症细胞浸润，提示了FGL2基因沉默对ANP的保护作用。此外，免疫细胞， 特别是与先天免疫相关的炎症细胞(包括中性粒细胞、 巨噬细胞等)，它们介导并放大了级联样的促炎反应，决定着ANP的严重程度[14]。研究显示，在ANP病程的不同时期，通过促进或抑制中性粒细胞及CD4+T细胞的凋亡，可减轻早期ANP炎性应答，缓解ANP症状[15-16]。本研究结果显示，Ad-FGL2-siRNA显著下调了促炎症细胞因子TNF-α和IL-1β水平，这对阻止局部组织损伤发展为系统炎症反应起到了关键作用[9]，促炎细胞因子的下调也与上述胰腺病理学损伤的缓解相一致。本研究结果还显示，Ad-FGL2-siRNA在ANP早期抑制了腺泡细胞的凋亡，这与上述沉默FGL2可抑制其他系统疾病的细胞凋亡结论相一致[2]。综上所述，FGL2可能参与了小鼠ANP的发生发展，沉默FGL2基因表达，可抑制炎症细胞的聚集和浸润，抑制腺泡细胞的凋亡，从而对ANP早期起到一种保护作用。