黄芪甲苷调控HO-1抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用研究

杨萍，周玉平，常秀春，王凤，李高文

(1.宁波卫生职业技术学院 护理学院，浙江 宁波 315100;2.宁波大学医学院附属医院，浙江 宁波 315000)

心肌缺血再灌注损伤的中医病因病机以心气虚衰为本，心血瘀阻、痰浊内生为标，为本虚标实证，中医药治疗以益气养心扶正以固本，活血化瘀祛痰以治标[1]。黄芪是历代医家治疗心血管疾病最常用的中药。黄芪甲苷(Astragaloside-Ⅳ, AS-Ⅳ)是黄芪药理活性的主要物质之一，具有包括抗缺血/再灌注损伤作用在内的多种心血管药理作用[2]。黄芪甲苷防治心血管疾病的机制主要与抗氧化、抗炎作用有关[3-4]，但其具体的靶向分子及信号通路尚不十分明确。

血红素氧化酶1(Heme oxygenase，HO-1)是一种应激反应蛋白，在各种病理性刺激时诱导产生。HO-1通过降解氧化型血红素，产生具有抗氧化作用的胆红素和具有抗炎作用的一氧化碳，因此近年来被公认为是一种重要的抗氧化剂及组织保护酶[5]。研究发现，HO-1对具有心肌细胞损伤具有保护作用[6]。HO-1是否介导了黄芪甲苷对缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤的心肌细胞保护作用值得研究与证实。本研究以原代心肌细胞H/R心肌损伤模拟心肌缺血再灌注损伤，探讨黄芪甲苷抗H/R损伤作用机制，为阐释中药抗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠乳鼠，SPF 级，出生1～3 d，雌、雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2016-0011。

1.2 药物与试剂

黄芪甲苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：170614， 纯度≥99%)；原卟啉氯化钴(Copp)、原卟啉Ⅸ锌(Ⅱ)络合物(Znpp)、四甲基唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国GIBCO 公司；兔抗小鼠GAPDH 多克隆抗体和兔抗小鼠HO-1 多克隆抗体购自Santa Cruz；过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 购自北京中杉生物技术有限公司。RIRP裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-AGE凝胶配置试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

生物洁净工作台(苏州安泰空气有限公司)；恒温二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 心肌细胞原代培养

参考文献[7]方法进行心肌细胞原代培养：取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，无菌条件下取出心脏，胰酶消化法将心肌组织逐步分离成单个心肌细胞，接种至培养瓶，置于37℃，5% CO2饱和湿度的孵箱中培养90 min后，差速贴壁去除成纤维细胞。将纯化后的心肌细胞调整浓度，接种至6孔板或96孔板中，每24 h更换1次培养液。72 h后心肌细胞已成片搏动，当细胞基本融合时进行实验。

2.2 H/R损伤模型复制

参照文献[8]并加以改进建立心肌细胞H/R模型。将培养的心肌细胞以模拟缺血溶液置换正常培养液，置于缺氧装置中培养4 h，即为缺氧模型。再换用模拟再灌注溶液，于常氧环境中培养4 h，即为复氧模型。

2.3 AS-Ⅳ给药浓度确定

将心肌细胞悬液以5×104个/mL接种于96 孔板，留出1个孔不加细胞悬液，作为空白对照组。当细胞培养至融合成片搏动时，加入含不同浓度黄芪甲苷的培养液(终浓度分别为1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)，同时设立正常对照组(不干预)、模型组(H/R)，继续培养24 h 。MTT法测定心肌细胞活力，以测定吸光度(A)，取平均值计算

细胞活力=A药液-A空白/A正常对照-A空白×100%

2.4 细胞分组及干预

心肌细胞悬液以5×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL。留出1个孔不加细胞悬液，作为空白对照组。将培养的心肌细胞随机分为6组：①正常对照组(Normal control);②H/R组；③H/R+AS-Ⅳ组(造模后给予AS-Ⅳ100 μmol/L干预24 h)；④H/R+Copp(造模后给予终浓度为20 μmol/L Copp干预24 h)组；⑤H/R+Znpp(造模后给予终浓度为20 μmol/L Znpp干预24 h)组。⑥H/R+Znpp+AS-Ⅳ(造模后给予终浓度为20 μmol/L Znpp干预24 h，再给予AS-Ⅳ100 μmol/L干预24 h)组 。每个组设置6个复孔。

2.5 MTT测定细胞活力

按实验分组给予相应的处理因素后弃去上清液，每孔加入MTT溶液(终浓度为0. 5 mg/L)100 μL，继续孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min至蓝紫色结晶甲瓒充分溶解，在波酶标仪490 nm处检测其吸光度A。取平均值计算细胞活力。

2.6 cTnT、SOD、GSH-PX含量的测定

取各组培养液，按试剂盒操作说明检测心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量。

2.7 hs-CRP、TNF-α含量的测定

按实验分组给予相应的处理因素后，取各组培养液，按试剂盒操作说明采用ELISA法检测细胞上清液中超敏C反应蛋白(Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。

2.8 Western blot测定HO-1蛋白表达

心肌细胞悬液以5×105个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL。按实验分组给予相应的处理因素后收集细胞，裂解细胞并提取总蛋白，根据BCA 蛋白定量法检测各蛋白浓度。取样品蛋白质50 μg，与SDS上样缓冲液混合，95～100℃变性5 min；制胶，上样，电泳，切胶，半干转膜器恒压12V转PVDF膜60 min，PBST洗膜10 min×3次,以5% BSA/PBS封闭1 h， 加入一抗中4℃轻摇孵育过夜，PBST洗膜10 min×3次, 加入二抗室温轻摇孵育1 h，将膜置于Kodak Image Station 2000MM成像系统曝光，获取目的条带图像。Image J软件分析灰度值，以GAPDH为内参，计算蛋白相对表达量。取3次重复实验结果的均值进行比较。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 各组心肌细胞活力比较

心肌细胞经H/R处理后，H/R组细胞活力较正常对照组显著降低，说明H/R可造成心肌细胞损伤。随着AS-Ⅳ药液浓度的增加，细胞活力呈浓度依赖性增高，与H/R模型组比较差异具有统计学意义，说明黄芪甲苷呈浓度依赖性减轻H/R诱导的细胞损伤，确定AS-Ⅳ干预浓度为100 μmol/L，结果见表1。

本实验结果显示，与H/R组比较，HO-1诱导剂CoPP可显著增加心肌细胞活力，而HO-1抑制剂ZnPP组细胞活力显著降低，说明增加HO-1含量可减轻H/R诱导的细胞损伤；心肌细胞经H/R预处理后，给予AS-Ⅳ干预24 h，细胞活力较H/R模型组显著改善。结果见表2。

表1 不同浓度AS-Ⅳ对H/R损伤心肌细胞模型细胞活力的影响

注：与Normal control组比较，P<0.05；与H/R组比较，P<0.05

表2 各组心肌细胞活力比较

注：与Normal control组比较，P<0.05；与H/R组比较，P<0.05

3.2 各组心肌细胞cTnT、SOD、GSH-PX水平比较

与Normal control组比较，H/R组心肌细胞SOD、GSH-PX活性显著降低，而cTnT活性显著增加，ZnPP则显著加重H/R导致的上述指标变化，说明ZnPP可加重H/R导致的氧化平衡体系失衡；黄芪甲苷、CoPP可显著增加H/R预处理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，说明黄芪甲苷、CoPP对心肌细胞的保护作用与抗氧化作用有关。结果见表3。

表3 H/R预处理后各组细胞cTnT、SOD、GSH-PX水平

注：与Normal control组比较，P<0.05；与H/R组比较，P<0.05

3.3 各组细胞上清hs-CRP、TNF-α水平比较

心肌细胞经H/R预处理后，细胞上清炎症因子hs-CRP、TNF-α表达较正常对照组显著增高(P均=0.000)，ZnPP则显著加重H/R导致的上述指标变化，说明ZnPP可进一步促进H/R诱导的炎症因子hs-CRP、TNF-α的表达。经黄芪甲苷、CoPP干预后，细胞上清中hs-CRP、TNF-α水平显著降低，说明黄芪甲苷、CoPP可减轻H/R诱导的炎症因子表达。结果见表4。

3.4 各组心肌细胞HO-1蛋白表达水平比较

与H/R组比较，心肌细胞经H/R+COPP干预后HO-1蛋白表达显著增高，经ZnPP干预后HO-1蛋白表达显著下降；与H/R组比较，经AS-Ⅳ干预后，HO-1蛋白表达显著升高，且与H/R+COPP组无显著差异，说明AS-Ⅳ可促进心肌细胞HO-1蛋白表达。结果见图1。

表4 H/R预处理后细胞上清hs-CRP、TNF-α表达的影响

注：与Normal control组比较，P<0.05；与H/R组比较，P<0.05

图1 各组细胞中HO-1蛋白表达的比较

4 讨论

近年来，随着对心肌缺血再灌注损伤研究的不断深入，氧自由基损伤、炎症介质释放被认为是心肌缺血再灌注损伤发生发展过程中的始动因素[9]。因此，维持体内氧化平衡体系的稳定，干预炎症是保护心肌细胞的重要手段。越来越多的研究证实，增加HO-1基因表达可通过多种途径发挥心血管保护作用，如抗缺血再灌注损伤，抗动脉粥样硬化和增加斑块的稳定性，抑制心肌肥厚，抑制心肌细胞凋亡等[10-11]。本研究通过给予HO-1特异性激动剂钴原卟啉或抑制剂锌原卟啉对H/R造模后心肌细胞进行干预，发现HO-1诱导剂CoPP可改善心肌细胞H/R损伤所致的细胞活力下降，增强抗氧化酶活性，抑制炎症因子表达，而HO-1抑制剂ZnPP则进一步加重H/R损伤所致的细胞损伤。说明HO-1抗心肌细胞H/R损伤与抑制炎症因子表达，抗氧化应激有关。因此，HO-1是治疗心血管疾病的一个很好的潜在靶点，通过各种方式诱导HO-1表达必然在缺血再灌注损伤时的细胞保护方面发挥重要作用。

根据心肌缺血再灌注损伤患者临床特征，中医学者认为其病机心气虚衰为本，故其治则当以益气养心扶正以固本。动物实验及和临床实际观察的基础上已证明多种中药和中药复方有一定的保护作用，其机制多以抗氧化、抗炎为主[12]。黄芪味甘，微温，归脾、肺经，具有健脾补中，补气固表、升阳举陷、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效，成为中医临床常用补益中药。黄芪甲苷是黄芪药理活性的主要物质之一，为黄芪制剂质量鉴定的指标成分，在药典中被作为黄芪质量检测标志物。实验研究证实黄芪甲苷对多种心肌细胞损伤模型具有显著的保护作用，具有增强心肌收缩力，改善心肌能量代谢，抑制心肌纤维化和心肌细胞凋亡作用[13-14]。本实验结果显示：黄芪甲苷可显著增高HO-1蛋白表达水平；与模型组比较，黄芪甲苷干预后的心肌细胞活力呈浓度依赖性增高，显著增加H/R预处理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，降低炎症因子hs-CRP、TNF-α表达。当H/R心肌细胞预先经HO-1抑制剂ZnPP预处理后，再进行黄芪甲苷干预，结果显示：与模型组比较，其细胞活力、氧化平衡体系、炎症因子表达无显著性差异。由此可以明确，黄芪甲苷可减轻H/R诱导的细胞损伤，其作用机制之一可通过诱导HO-1蛋白的表达，通过HO-1介导的抗氧化、抗炎作用发挥抗心肌细胞H/R损伤作用。