槟榔碱不同配伍环境下在肝微粒体中的代谢研究

王豪，张久旭，李梦薇，韩星，温浩然，冀艳华，刘洋

(北京中医药大学，北京 100029)

槟榔为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子。味苦、辛，性温，具有杀虫，行气，利水，消积，截疟的作用。2003年，世界卫生组织把槟榔列入一级致癌物名录。研究表明槟榔具有增加肝硬化和肝细胞癌的风险，对人和动物具有生殖系统毒性[1]。并有研究认为槟榔的毒性主要是由槟榔碱产生[2-3]。另有报道指出槟榔在正常剂量下使用，可能会出现中毒反应，如腹痛、呕吐、流涎、呼吸急促等症状[4]。槟榔中的主要化学成分为生物碱、脂肪酸和鞣质，其中以槟榔碱含量最高。但是，槟榔水煎液中去甲槟榔次碱含量最高，这是否影响槟榔的药效或者毒副作用，有待进一步研究。四磨汤源于宋代医家严用的《严氏济生方》，全方由槟榔、乌药、枳壳、木香组成，可顺气降逆、消积止痛，在临床使用中具有良好的治疗效果，未见有相关毒副作用的研究。

中药配伍减毒增效的作用机制一直是中药研究中的一个重要方向，肝脏作为机体解毒的重要器官，也常作为研究药物毒性作用机制的器官。基于槟榔碱或槟榔水煎液的毒性和四磨汤的无毒性，本文采用体外肝微粒温孵的方法，清晰明了的刻画出槟榔碱在不同配伍环境下的代谢变化情况。此外，由于槟榔水煎液中去甲槟榔次碱含量最高，去甲槟榔碱和槟榔次碱含量与槟榔碱接近，并且化学结构相似，因此，我们怀疑槟榔水煎液的毒性是否与此有关。在研究和分析检测中我们加入了这三种生物碱，以观察它们的代谢行为及对槟榔碱代谢行为的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器

WATERS 600液相色谱系统(Milford，MA，USA)，由 Delta 600四元泵和2487双波长紫外检测器组成，工作站为 Millennium 32；恒温水浴锅( HH-6，金坛市朗博仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(GL-21M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；电子分析天平(BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司)；酶标仪(SpectraMax L，美谷分子仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

槟榔(北京仟草中药饮片有限公司提供，产地广东)，四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司生产)。氢溴酸槟榔碱购于中国药品生物制品检定所，盐酸槟榔次碱购于阿法埃莎(中国)化学有限公司，氢溴酸去甲槟榔碱购于成都思天德生物科技有限公司，盐酸去甲槟榔次碱购于Bio-Techne中国分公司。非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、氧化型辅酶Ⅱ、D-葡萄糖-6-磷酸二钠(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)均购于北京拜尔迪生物科技有限公司；奥美拉唑购于北京伊诺凯科技有限公司；睾酮购于北京伊诺凯科技有限公司；SD雄性大鼠肝微粒体购于北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.3 药物制备

取槟榔饮片100 g，置具有冷凝回流装置的圆底烧瓶中，加1 000 mL水，浸泡1 h后回流提取1 h，趁热过滤出提取液。滤液经过旋转蒸发浓缩，制成含生药约0.5 g/mL的溶液，备用。

1.4 对照品溶液配制

精密称取氢溴酸槟榔碱7.65 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用10%甲醇水定容至刻度，得0.503 mg/mL的对照品溶液，备用。同法，分别称取盐酸槟榔次碱6.30 mg、氢溴酸去甲槟榔碱6.25 mg、盐酸去甲槟榔次碱6.46 mg，得到浓度分别为0.501 mg/mL、0.500 mg/mL、0.502 mg/mL的标准溶液，备用。

1.5 温孵体系

精密取探针混合底物50 μL(浓度分别为非那西丁200 μmol/L、氯唑沙宗400 μmol/L、甲苯磺丁脲400 μmol/L、奥美拉唑200 μmol/L、睾酮400 μmol/L)或50 μL槟榔水煎液(浓度为0.5 mg/mL)或50 μL四磨汤溶液或50 μL槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和去甲槟榔次碱溶液，浓度均为200 μg/L，于离心管中，氮气吹干后，加入50 μL含有100 mM Tris-HCl 缓冲液，震荡使底物溶解后，加入50 μL浓度约为2 mg/mL大鼠肝微粒体蛋白，于37℃水浴中温孵5 min，加入100 μL NADPH 再生系统(含有2 mmol/L NADPNa2，20 mM G-6-P，4 U/mL G-6-PDH，20 mmol/L MgCl2)，水浴中反应30 min，取出，立即加入200 μL冰冷的乙腈终止反应，4℃ 15 000 g离心10 min，取上清液进行液相分析[5]。

1.6 分析方法

色谱柱为Ultimate XB-SCX(5 μm，4.6 mm×250 mm)。柱温箱温度为35℃；检测波长为215 nm，280 nm。分析时采用流速1 mL/min的梯度洗脱系统：A(0.2%磷酸，浓氨水调pH 3.8水溶液)-B(80%乙腈)(50∶ 50)洗脱时间为15 min。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性

在“1.6”色谱条件下测得空白孵育体系、空白孵育体系加入对照品的谱图见图1，在本实验条件下，内标有槟榔次碱、去甲槟榔次碱、槟榔碱和去甲槟榔碱，保留时间分别为9.416、11.603、20.275、22.604 min，结果表明该体系中内源性物质和其他代谢产物均不干扰待测物及内标的测定。

注：A.空白温孵体系;B.空白孵育体系加入对照品图1 专属性实验色谱图

2.1.2 标准曲线

将“1.4”中的储备液依次稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/L浓度的溶液，进样分析，测定其峰面积，求得槟榔次碱、去甲槟榔次碱、槟榔碱和去甲槟榔碱的标准曲线方程分别为Y=0.000 088X-10.046 821(r=0.999 1)、Y=0.000 084X-1.326 063(r=0.996 7)、Y=0.000 072X-3.614 874(r=0.999 3)、Y=0.000 096X-8.577 336(r=0.998 9)，表明四种生物碱在3.125～100 μg/L浓度范围内均呈现良好的线性。

2.1.3 回收率和精密度

分别配制槟榔碱(Arecoline)、槟榔次碱(Arecaidine)、去甲槟榔碱(Guvacoline)、去甲槟榔次碱(Guvacine)四种生物碱 100、10、4 μg/L浓度的标准溶液各 3 份，进样分析，记录峰面积。配制上述相同浓度的孵育体系溶液，按照“1.5”项下依法操作，不同点在于加入微粒体后立即加入冰冷的乙腈终止反应，制备3份样品，进样分析，记录峰面积，考察回收率。同日和连续 3 天各处理 3 份样品，计算日内RSD和日间RSD，结果见表1。

表1 肝微粒体酶孵育体系中槟榔四种生物碱的精密度及回收率

2.1.4 稳定性

分别配制槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱四种生物碱100、10、4 μg/L浓度的酶孵育样品溶液各5份，按“1.5”方法进行样品处理后，分别在0和4 h进行测定，四种生物碱的RSD值均小于5%。样品在-20℃条件下冻融3次，四种生物碱的RSD值均小于7%。

2.2 槟榔四种生物碱在肝微粒体中代谢前后的含量变化

由于槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和去甲槟榔次碱的结构非常相似，并且依次去掉一个氮甲基或羧甲基，所以，我们认为槟榔碱在代谢过程中很有可能生成另外三种生物碱，因此，在检测指标中加入了另外三种生物碱。比较各组代谢产物中槟榔生物碱的含量,按照公式1的方式进行计算，数据汇总见表2。

表2 槟榔生物碱体外温孵实验结果(n=3)

注：(+)表示酶有活性；(-)表示酶没有活性

实验组变化率=(对照组含量-实验组含量)/对照组含量×100%(公式1)

通过分析各个实验组和对照组数据，我们可以发现：①当在肝微粒体中温孵槟榔水煎液时，除了槟榔次碱外，其他三种生物碱含量均明显减少；②当单独在肝微粒体中温孵槟榔碱时，代谢产物中槟榔次碱含量明显增高；③当在肝微粒体中温孵四磨汤时，除了去甲槟榔次碱含量明显增多之外，其他三种生物碱含量均明显减少。基于这些现象，我们补充了实验组编号为4～7的四组实验，以观察另外三种生物碱单独使用时以及四种生物碱配合使用时在肝微粒体温孵体系中的代谢情况。通过比较实验组和对照组数据可以发现：④当在肝微粒体中温孵四种槟榔生物碱时，槟榔碱和去甲槟榔碱含量减少，其中槟榔碱含量明显减少，槟榔次碱和去甲槟榔次碱含量则明显增多；⑤当单独在肝微粒体中温孵槟榔次碱时，代谢产物中去甲槟榔次碱含量明显增高；⑥当单独在肝微粒体中温孵槟榔碱时，代谢产物中槟榔次碱含量明显增高；⑦当单独在肝微粒体中温孵去甲槟榔碱时，代谢产物中去甲槟榔次碱含量明显升高。

3 结论

通过上述实验我们认为槟榔碱能够在肝微粒体中被代谢为无毒的槟榔次碱，从而达到减毒效果。而四磨汤中的某个或某些成分能够促进肝微粒体对槟榔碱的代谢，从而达到配伍减毒的效果。

4 讨论

在本文研究之前我们进行了预实验：将12只SD雄性大鼠随机分成两组，分别灌胃含槟榔生药材量一样的槟榔水提液和四磨汤，连续3 d。结果槟榔水提液组的大鼠全部死亡，而四磨汤组大鼠则正常存活，由此现象我们认为槟榔水提液具有一定的毒性，而相同浓度下的四磨汤则没有毒性。并且通过分析槟榔水提液中生物碱的含量，发现主要存在四种生物碱，分别为槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱和去甲槟榔碱，其中去甲槟榔次碱的含量约为槟榔碱含量的3倍。所以，我们认为关于槟榔水煎液在临床应用产生毒副作用相关的报道案例较少的可能原因之一就在于此。同时，这说明槟榔在水煎煮提取过程中，可能是由于水对槟榔碱的提取不完全或者是槟榔碱长时间加热遭到了破坏所致，也印证古人所说的“槟榔见火无功”的说法。此外，古人在应用四磨汤的时候强调要采用“磨取汁，温服”的方法才能起到快速发挥药效的作用，大概的缘由之一就在于此吧。

综上，通过我们的研究，初步认为四磨汤中存在促进槟榔碱代谢的成分，从而达到配伍减毒的效果。关于中药配伍减毒作用机制更加清晰具体的研究有待进一步开展。