胶质瘤组织中Bcl-2相关抗凋亡基因3表达及其对U87细胞增殖和侵袭能力的影响

赵 岗，杜 伟，魏新亭，王进忠，程振国

(1.新乡市中心医院神经外科，河南 新乡 453000；2.郑州大学第一附属医院神经外科，河南 郑州 451000)

胶质瘤是恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤，其增殖能力强、浸润性生长，且与周边脑组织边界不清，患者中位生存时间约1 a[1]。目前，尽管临床诊断及治疗胶质瘤的技术不断进步，但患者预后并未明显改善[2]。研究表明，胶质瘤的发生与进展是多基因、多步骤共同作用的结果[3]。Bcl-2相关抗凋亡基因(Bcl-2-associated anti-apoptotic gene，BAG)作为可与热休克蛋白70结合的一组伴侣蛋白家族，其与组织发育、细胞自噬、迁移、凋亡、骨架形成等多种生物学功能密切相关[4]。BAG3是BAG家族的主要成员，研究表明，BAG3在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，在促进肿瘤细胞生长、抗凋亡、多药耐药等过程中发挥重要作用[5]。本研究进一步探讨BAG3蛋白在胶质瘤组织中的表达，分析其与胶质瘤临床病理特征的关系，并利用小分子RNA干扰(small interfering RNA，siRNA)技术特异性沉默人胶质瘤U87细胞中BAG3基因，观察其对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，以期为胶质瘤发病机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1标本来源选取2011年4月至2017年4月于新乡市中心医院神经外科手术切除的胶质瘤组织及癌旁组织(距瘤旁边缘>2 cm)标本各73例，男39例，女34例；年龄19～77(51.2±10.4)岁；肿瘤分级[6]：Ⅰ级6例，Ⅱ级22例，Ⅲ级17例，Ⅳ级28例。所有患者术前未接受放射治疗和化学治疗，术后经病理学检查确诊。胶质瘤组织及癌旁组织经甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究通过医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2试剂与仪器免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人BAG3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，人胶质瘤U87细胞由新乡医学院基础医学院提供，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)和胎牛血清购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录和扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司，BAG3和内参引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，siRNA-BAG3和siRNA-对照序列由上海吉玛制药技术有限公司合成，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)购自南京凯基生物科技股份有限公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素标记/碘化丙啶(annexin V-flourescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell小室购自美国Coster公司；倒置相差显微镜购自上海绘统光学仪器有限公司，实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪购自美国ABI公司，全自动凝胶电泳分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.3实验方法

1.3.1免疫组织化学法检测胶质瘤组织和癌旁组织中BAG3蛋白表达取石蜡标本，连续切片，厚度约 5 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，浸入30 g·L-1过氧化氢溶液中20 min以阻断内源性过氧化物酶；置于乙二胺四乙酸溶液中，微波加热至98 ℃持续 15 min，冷却后加入山羊血清，室温下孵育 10 min；加入一抗(兔抗人BAG3多克隆抗体，稀释比例11 200)，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次；加入二抗，室温孵育60 min；二氨基联苯胺染色，苏木精复染，脱水、透明、中性树脂封片；以PBS替代一抗作为阴性对照，光学显微镜下观察。每张切片均由2位病理科副主任医师独立完成阅片，BAG3蛋白主要表达于细胞质和细胞膜。根据染色强度和阳性细胞比例采用半定量法进行评估[7]：(1)阳性细胞比例≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；(2)染色强度：无染色为0分，呈淡黄色为1分，呈黄棕色为2分，呈棕黄或黄褐色为3分；(3)以阳性细胞比例得分和染色强度得分的乘积对结果进行判定，0分为阴性，1～6分为弱阳性，>6分为强阳性；以阴性或弱阳性作为BAG3蛋白低表达，以强阳性作为BAG3蛋白高表达。

1.3.2U87细胞培养及分组将U87细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM中，于含体积分数5%CO2的37 ℃恒温箱中培养。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，接种于6孔板中培养，待细胞融合度达70%以上时进行分组，并利用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染：(1)siRNA-BAG3组：转染BAG3干扰序列5′-AAGGUUCAGACCAUCUUGGAA-3′；(2)siRNA-对照序列组：转染阴性对照序列5′-CCGUAUCGUAAGCAGUACU-3′；(3)空白对照组：不作任何处理。转染后继续培养48 h，完成后续实验。

1.3.3实时荧光定量PCR法检测各组U87细胞中BAG3mRNA表达取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，加入细胞裂解液，用TRIzol法获得各组细胞中总RNA，并检测总RNA纯度。取10 μg总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增。引物序列：BAG3上游引物序列为5′-CATCCAGGAGTGCTGAAAGTG-3′，下游引物序列为5′-TCTGAACCTTCCTGACACCG-3′；β-actin上游引物序列为5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游引物序列为5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAG-3′。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续循环38次，每个样本均设3个平行反应复孔。采用2-△△Ct法获得各组细胞中BAG3 mRNA相对表达量。

1.3.4Westernblot法检测U87细胞中BAG3蛋白表达取各组转染培养48 h的细胞，加入细胞裂解液，用总蛋白提取试剂盒获得总蛋白，用二喹啉甲酸法蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度。取 60 μg 总蛋白，应用120 g·L-1十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至聚偏氟乙烯膜上，室温下以50 g·L-1脱脂奶粉封闭60 min，将一抗兔抗人BAG3多克隆抗体按1500稀释后加入，4 ℃过夜孵育，含Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤3次，将二抗按15 000稀释后加入，室温下孵育 60 min，含Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤3次；内参为磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。利用Image J图像分析软件对各条带灰度值进行分析，获得细胞中BAG3蛋白相对表达量。

1.3.5CCK-8法检测U87细胞增殖情况取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，接种于96孔板，调整细胞密度为每孔2×103个，每组设6个复孔，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM，37 ℃ 恒温培养，分别于培养12、24、48、72、96 h时加入CCK-8液10 μL，摇晃均匀，避光孵育 120 min，应用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度。

1.3.6克隆形成实验检测U87细胞克隆能力取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，接种6孔板，调整细胞密度为每孔200个，每组设6个复孔，培养10 d后，多聚甲醛固定20 min，5 g·L-1结晶紫染色25 min，以≥50个细胞作为1个克隆，计数各组细胞克隆数量。

1.3.7流式细胞仪检测U87细胞凋亡情况取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，接种于96孔板，调整细胞密度为1×109L-1，取1 mL细胞悬液，置于离心管内，4 ℃下1 000 r·min-1离心10 min，留取沉淀，PBS冲洗3次，加入结合缓冲液200 μL，充分混匀，分别加入Annexin V和PI各 5 μL，避光反应15 min，加入结合缓冲液400 μL，60 min 内检测细胞凋亡情况。

1.3.8Transwell小室检测U87细胞侵袭能力将Matrigel胶平铺于Transwell小室上室，风干后备用。取各组转染培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，PBS重悬细胞，调整细胞密度为2.5×109L-1，取 200 μL 细胞悬液加入小室上室，500 μL含体积分数10%胎牛血清的培养液加入下室，于37 ℃恒温培养24 h，取出小室，弃去多余的培养液，多聚甲醛固定，结晶紫染色，用棉签将散落细胞轻轻除去，利用倒置显微镜观察，随机取10个高倍视野，计数穿膜细胞数。实验重复3次。

2 结果

2.1胶质瘤组织和癌旁组织中BAG3蛋白表达比较结果见图1。胶质瘤组织中BAG3蛋白高表达率为73.97%(54/73)，低表达率为26.03%(19/73)；癌旁组织中BAG3蛋白高表达率为36.99%(27/73)，低表达率为63.01%(46/73)；胶质瘤组织中BAG3蛋白高表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=20.215，P<0.05)。

A：癌旁组织；B：Ⅰ级胶质瘤；C：Ⅱ级胶质瘤；D：Ⅲ级胶质瘤；E：Ⅳ级胶质瘤。

图1胶质瘤组织和癌旁组织中BAG3蛋白表达(免疫组织化学，×400)

Fig.1ExpressionofBAG3proteiningliomatissuesandadjacenttissues(immunohistochemistry，×400)

2.2BAG3蛋白表达与胶质瘤患者临床参数的关系结果见表1。胶质瘤组织中BAG3蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径及Karnofsky评分无关(P>0.05)，而与肿瘤分级有关(P<0.05)。

表1BAG3蛋白表达与胶质瘤患者临床参数之间的关系

Tab.1RelationshipbetweenBAG3proteinexpressionandclinicalparametersinpatientswithglioma

临床参数nBAG3蛋白高表达/例(%)低表达/例(%)χ2P年龄 ≥50岁4734(72.34)13(27.66)0.1830.669 <50岁2620(76.92)6(23.08)性别 男3930(76.92)9(23.08)0.3790.538 女3424(70.59)10(29.41)肿瘤位置 小脑幕上5945(76.27)14(23.73)0.8440.358 小脑幕下149(64.29)5(35.71)肿瘤直径 >3 cm3827(71.05)11(28.95)0.3510.554 ≤3 cm3527(77.14)8(22.86)Karnofsky评分 >801913(68.42)6(31.58)0.4110.521 ≤805441(75.93)13(24.07)肿瘤分级 Ⅰ～Ⅱ级2816(57.14)12(42.86)6.6820.010 Ⅲ～Ⅳ级4538(84.44)7(15.56)

2.33组U87细胞中BAG3mRNA表达比较siRNA-BAG3组、siRNA-对照序列组和空白对照组U87细胞中BAG3 mRNA相对表达量分别为1.42±0.11、2.17±0.12和2.31±0.18；siRNA-BAG3组U87细胞中BAG3 mRNA相对表达量显著低于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(t=11.236、10.480，P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组U87细胞中BAG3 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.708，P>0.05)。

2.43组U87细胞中BAG3蛋白表达比较结果见图2。siRNA-BAG3组、siRNA-对照序列组和空白对照组U87细胞中BAG3蛋白相对表达量分别为0.20±0.12、0.84±0.13和0.92±0.12；siRNA-BAG3组U87细胞中BAG3蛋白相对表达量显著低于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(t=8.956、10.460，P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组U87细胞中BAG3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.074，P>0.05)。

图23组U87细胞中BAG3蛋白表达(Westernblot)

Fig.2ExpressionsofBAG3proteininU87cellsinthethreegroups(Westernblot)

2.53组U87细胞增殖能力比较结果见图3和表2。培养12 h时3组U87细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72、96 h时siRNA-BAG3组U87细胞增殖能力显著低于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组U87细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图33组U87细胞增殖能力比较

Fig.3ComparisonoftheproliferationabilityofU87cellsamongthethreegroups

表23组U87细胞增殖能力比较

组别n细胞增殖能力(吸光度)培养12 h培养24 h培养48 h培养72 h培养96 h空白对照组60.11±0.020.43±0.030.51±0.020.67±0.120.79±0.03siRNA-对照序列组60.14±0.070.39±0.040.49±0.050.70±0.070.82±0.12siRNA-BAG3组60.12±0.020.27±0.05a0.36±0.03a0.50±0.07a0.60±0.06aF0.68724.35628.9759.15213.797P0.5180.0000.0000.0030.000

注：与siRNA-对照序列组和空白对照组比较aP<0.05。

2.63组U87细胞克隆形成能力比较结果见图4。克隆形成实验结果显示，siRNA-BAG3组、siRNA-对照序列组和空白对照组U87细胞克隆形成数分别为30.76±6.19、81.32±3.55、85.07±3.05；siRNA-BAG3组U87细胞克隆形成数显著少于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(t=17.349、19.278，P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组U87细胞克隆形成数比较差异无统计学意义(t=1.968，P>0.05)。

A：siRNA-BAG3组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组。

图43组U87细胞克隆形成能力比较

Fig.4ComparisonofthecolonyformingabilityofU87cellsamongthethreegroups

2.73组U87细胞凋亡率比较siRNA-BAG3组、siRNA-对照序列组和空白对照组细胞凋亡率分别为(21.43±6.89)%、(5.50±2.95)%、(7.37±3.31)%；siRNA-BAG3组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(t=5.208、4.508，P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=1.031，P>0.05)。

2.83组U87细胞侵袭能力比较结果见图5。siRNA-BAG3组、siRNA-对照序列组和空白对照组侵袭细胞数分别为116.92±8.82、179.00±11.64、172.48±18.16；siRNA-BAG3组侵袭细胞数显著少于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异均有统计学意义(t=10.410、6.740，P<0.05)；siRNA-对照序列组与空白对照组侵袭细胞数比较差异无统计学意义(t=0.740，P>0.05)。

A：siRNA-BAG3组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组。

图53组U87细胞侵袭能力比较(结晶紫染色，×400)

Fig.5ComparisonoftheinvasiveabilityofU87cellsamongthethreegroups(crystalvioletstaining，×400)

3 讨论

胶质瘤是恶性脑肿瘤的主要类型，具有发病率高、生存率低等特点，5 a病死率仅次于胰腺癌和肺癌[8]，现有的治疗手段并不能明显延长患者生存时间[9-10]。研究表明，侵袭性生长是胶质瘤难以根治且易复发的主要因素[11]。因此，积极探讨影响胶质瘤细胞增殖及侵袭力的相关机制，有望为改善患者预后提供思路。BAG3作为一种抗凋亡蛋白，是热休克蛋白70重要的伴侣蛋白，可通过与热休克蛋白70结合而在多种病理生理过程中发挥重要作用，在维持及促进肿瘤细胞增殖、生存及迁移等过程中起关键性作用[5]，与白血病[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]等多种恶性肿瘤的发生、进展密切相关。本研究结果显示，胶质瘤组织中BAG3蛋白表达显著高于癌旁组织，说明BAG3蛋白可能参与了胶质瘤的发生与发展。本研究结果显示，BAG3蛋白表达与胶质瘤分级有关，分级越高，BAG3蛋白表达越高，提示BAG3蛋白表达与胶质瘤恶性程度有关，其可能参与了胶质瘤的发展过程。

为进一步探讨BAG3与胶质瘤细胞生物学特性的关系，本研究利用siRNA技术特异性沉默BAG3基因，实时荧光定量PCR和Western blot实验结果显示，siRNA-BAG3组U87细胞中BAG3 mRNA和蛋白相对表达量均降低，提示人胶质瘤U87细胞中BAG3基因表达被成功沉默。有研究指出，BAG3可通过促进热休克蛋白70与细胞凋亡相关基因Bax结合而阻断Bax介导的细胞凋亡，从而促进细胞存活[15]。本研究CCK-8和克隆形成实验结果显示，与siRNA-对照序列组和空白对照组相比，24、48、72、96 h 时siRNA-BAG3组U87细胞增殖能力下降，且细胞克隆形成数量减少，说明特异性沉默BAG3基因表达可抑制U87细胞的增殖能力，提示BAG3可能参与了胶质瘤细胞增殖及生长过程。本研究结果显示，与siRNA-对照序列组和空白对照组相比，siRNA-BAG3组U87细胞凋亡率增加，说明特异性沉默BAG3基因可促进细胞凋亡发生。本研究结果显示，与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-BAG3组侵袭细胞数减少，说明特异性沉默BAG3基因可抑制U87细胞的侵袭能力，提示BAG3可能参与了胶质瘤细胞侵袭过程。

综上所述，BAG3蛋白在胶质瘤组织中呈高表达，且与肿瘤恶性程度有关，其可能通过促进人胶质瘤U87细胞增殖与侵袭、减少细胞凋亡而参与胶质瘤的发生和发展过程，有望为胶质瘤靶向治疗提供新的靶位。