人血清中拉莫三嗪浓度快速测定的高效液相色谱法

李 悦，贺志安，任方龙，马淑君，任明芬

(1.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003；2.新乡雅仕杰医学检验所质谱实验室，河南 新乡 453003；3.河南省免疫与靶向药物重点实验室，河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003；4.新乡医学院第二附属医院内科，河南 新乡 453002)

拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)是一种新型苯三嗪类抗癫痫药，主要用于治疗各种类型癫痫疾病，是儿童[1]和孕妇癫痫患者的首选药物，也可用于治疗各种类型情感障碍和抑郁症等。LTG通过抑制兴奋性神经递质谷氨酸和天门冬氨酸的释放，阻断突触前膜电压依赖性钠离子通道，抑制动作电位爆发，保证神经元的稳定性，从而发挥抗癫痫作用。由于LTG药物动力学和药效学个体差异较大，治疗窗较窄，且癫痫患者复发率高，易受联合用药[2]、怀孕[3]、药物代谢酶和转运体基因多态性[4]等多种因素影响，故需要对LTG进行血药浓度监测，以达到个体化的用药方案，确保不良反应与疗效之间的平衡。高效液相色谱法(high performance liquid chromatographic method，HPLC)技术应用较广泛，是监测LTG浓度的有效手段。国内外建立的一些测定LTG的HPLC法[5-6]预处理多采用萃取、氮吹等，操作复杂繁琐，分析时间长，可能影响临床医生的决策。本研究建立了简单、快捷、实用的测定人血清中LTG浓度的HPLC法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器LTG标准品(上海远慕生物科技有限公司，纯度>98%)，苯代三聚氰胺标准品[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，纯度>98%]，甲醇、乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)，乙酸铅(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)，人血清(新乡医学院第二附属医院提供)。ES Industries Sonoma C18(2)色谱柱(北京东方朗锐科技有限公司，50.0 mm×2.1 mm，3 μm)。高效液相色谱仪(日本岛津公司)，超纯水机(美国Pall Corporation公司)，十万分之一分析天平(日本岛津公司)，高速离心机(德国Centrifuge Eppedorf公司)，OF1旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)，EP管(中国罗氏公司)。

1.2LTG溶液配制精密称量LTG标准品粉末37.75 mg，置于100 mL容量瓶，用甲醇稀释定容得浓度为0.377 5 g·L-1的储备液备用。

1.3内标溶液配制精密称量216.09 mg苯代三聚氰胺标准品粉末，置于100 mL容量瓶，用甲醇稀释至100 mL，得到浓度为2.160 9 g·L-1的储备液，从中取250 μL置于100 mL容量瓶，得浓度为 5.40 mg·L-1的工作液。

1.4LTG色谱条件色谱柱：ES Industries Sonoma C18(2)(50.0 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：A相为超纯水，B相为纯甲醇，体积分数20%甲醇洗脱，流速为0.6 mL·min-1，进样量20 μL；柱温 40 ℃；紫外检测波长207 nm，分析时间6 min。

1.5样本处理取150 μL样本血清于1.5 mL EP管中，加入150 μL甲醇、150 μL苯代三聚氰胺、15 μL 0.40 g·mL-1的乙酸铅水溶液，充分涡旋混匀1 min后室温放置10 min，25 ℃ 12 000 r·min-1涡旋离心10 min，离心后取上清液300 μL置于已加入 300 μL 超纯水的进样瓶，混匀后吸样20 μL进行HPLC定量分析。

1.6方法学验证

1.6.1方法的选择性依据《中国药典》2015年版通则中“生物样品定量分析方法验证指导原则”[7]对所建方法进行验证。分别取6份未服用LTG的正常人血清考察选择性，不加苯代三聚氰胺，用150 μL甲醇、150 μL乙腈和15 μL乙酸铅沉淀蛋白，样本处理方法同“1.5项”操作，处理完样品按“1.4项”方法进行分析，以峰面积响应值衡量干扰组分。按照ISO151892012医学实验室-质量和能力认可准则的要求[8]对仪器进行校准，做好实验室各个环节的质量控制，规范工作流程，保证结果及时可靠。

1.6.2标准曲线依据药典要求[7]，将配制好的LTG储备液加入空白血浆中，得到LTG 为1.18、2.36、4.72、9.44、18.88、37.75 mg·L-1的血清标准品，余下操作同“1.5项”方法，处理完样品按“1.4项”方法进行分析。考察线性关系共做6套标准曲线，评价仪器对LTG分析物的响应，通过已知浓度的分析物与仪器检测真实值的比较建立标准曲线。

1.6.3准确度与精密度评价依据“标准曲线”自制LTG定量下限(1.18 mg·L-1)、低浓度(2.36 mg·L-1)、中浓度(18.88 mg·L-1)、高浓度(28.31 mg·L-1)质控样品，每个浓度5份，分3批在不同工作日测定，按“1.5项”方法操作，处理完样品按“1.4项”方法进行分析，计算批内、批间精密度与准确度。准确度是描述方法测定值与真实值的接近程度，准确度=(测定值/真实值)×100%，采用已知质控样品评估批内和批间准确度。精密度通过相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)评价，批内、批间RSD不超过15%，定量下限RSD不超过20%[7]。

1.6.4残留评价将接近定量上限浓度的高浓度样品(LTG浓度28.31 mg·L-1)加入到空白血清中制备高浓度质控样品，按“1.5项”方法处理，按“1.4项”方法进行分析，考察高浓度样品在空白样品中的残留。

1.6.5样本稳定性评价将配制好的LTG储备液加入到空白血清中，配成高浓度(28.31 mg·L-1)和低浓度(2.36 mg·L-1)血清质控样品，模拟样本血清，经“1.5项”方法处理后室温放置24 h，进行HPLC分析，每个浓度5份，评价LTG经沉淀蛋白法处理后室温放置24 h的稳定性情况。将未经蛋白沉淀处理的高、低浓度质控样品分别放置2～8 ℃冰箱存放1周后，按“1.5项”处理进行HPLC分析，每个浓度5份，评价样品在2～8 ℃ 放置1周的稳定性。

2 结果

2.1方法的选择性结果见图1。LTG、苯代三聚氰胺的保留时间分别为4.43、2.96 min，LTG、苯代三聚氰胺处均无干扰。

A：空白；B：LTG+苯代三聚氰胺。a：苯代三聚氰胺峰；b：LTG峰。

图1LTG和内标苯代三聚氰胺的选择性

Fig.1SelectivityofLTGandbenzoguanamine

2.2标准曲线结果见图2。LTG在1.18～37.75 mg·L-1的浓度范围内线性关系良好，标准曲线为Y=0.013 05X+0.032 38，r=0.999。

图2HPLC法测定LTG浓度的标准曲线

Fig.2StandardcurveforthedeterminationofLTGconcentrationbyHPLC

2.3精密度与准确度评价结果见表1。LTG在定量下限(1.18 mg·L-1)、低浓度(2.36 mg·L-1)、中浓度(18.88 mg·L-1)、高浓度(28.31 mg·L-1)质控样品批内及批间RSD均小于13.2%，样本适应性好，符合要求。

2.4残留评价结果各分析物在空白中的残留与定量下限浓度峰面积比值均<20%，内标在空白中的残留与定量下限浓度峰面积比值均<5%，因此该方法的残留结果符合要求，不影响准确度、精密度及样品结果的测定。

2.5样本稳定性评价结果见表2。处理过的血清质控样品室温放置24 h，样品的准确度结果稳定；未处理过的血清质控样品在2～8 ℃存放1周，样品的准确度结果稳定。

表1HPLC法测定LTG的准确度与精密度

质控样品浓度/(mg·L-1)n批内准确度/%第1批第2批第3批批内RSD/%第1批第2批第3批批间准确度/%批间RSD/%1.18584.07±2.77101.20±1.84114.75±1.293.301.821.1299.94±13.1313.132.36592.12±1.14100.08±0.82106.78±2.321.240.812.7199.66±6.376.3918.88599.57±0.9995.51±1.3996.02±0.821.001.460.8597.03±2.132.1928.31599.46±0.7097.91±1.29105.82±2.010.701.321.90101.06±3.783.74

表2HPLC法测定人血清中LTG的稳定性

Tab.2StabilityofthedeterminationofLTGinhumanserumbyHPLC

质控样品浓度/(mg·L-1)准确度/%24 h1周2.36105.0892.802.36103.8188.982.36104.2492.802.36105.0889.832.36104.2489.8330.20104.0793.0130.20105.3691.2930.20104.0195.8330.20102.8594.2130.20102.4594.30

3 讨论

LTG主要用于治疗癫痫及精神障碍类疾病，服用量过少达不到抗癫痫的效果，严重影响患者的生活质量，服用过量可引发各种不良反应。TERAO等[9]研究表明，LTG用药最常见的不良反应是皮疹。有研究显示，患有癫痫和情绪障碍的孕妇患者一线药物是LTG，而且体内血药浓度水平波动较大[3]，建议在孕前、孕中及分娩后对此药进行常规血药浓度监测。为达到病情控制与药物不良反应之间的平衡，一般建议临床医生使用神经精神药理学与药物精神病学协会专家组推荐治疗浓度范围(推荐浓度为3～14 mg·L-1，警戒浓度20 mg·L-1)[10]对癫痫患者进行剂量调整。但LTG的有效治疗浓度范围尚存在争议，国内学者普遍认为，LTG抗癫痫的治疗浓度范围是1～8 mg·L-1[11-13]，血药浓度大于 8 mg·L-1时不良反应发生率显著增加[13]。考虑到种族体质差异、个体差异性大，LTG受药物联合应用、基因多态性等因素影响较多，仅凭给药剂量很难确定体内LTG的真实浓度，仍需要通过药物浓度监测寻找最佳治疗浓度范围，使治疗方案更具个体化，因此需要建立简便、快速的HPLC法运用于临床服用LTG患者的药物浓度监测。

本研究建立HPLC法测定人血清LTG的血药浓度，依据《中国药典》2015年版四部中“生物样品定量分析方法验证指导原则”[7]对该方法进行验证。本实验中流动相选择纯甲醇和超纯水，体积分数20% B相等度洗脱，有助于延长色谱柱寿命，简化配比。采用苯代三聚氰胺作为内标，与LTG结构相似，保留时间适中，与样品峰无干扰，且性质稳定，物美价廉，可以满足内标的要求。以往测定方法的预处理大多采用甲醇沉淀蛋白法，而本研究采用甲醇和乙酸铅沉淀蛋白法测定LTG的浓度效果较好，离心后提取上清液即可上机处理，样品干净，检测结果准确。此方法操作简单、快速，采用ES Industries Sonoma C18(2)色谱柱能有效缩短分析时间，仅需 6 min 即可在液相色谱仪上完成1个标本的检测，且分离度较好，峰形较好，可以实现高通量样本的快速测定。经反复实验比较发现，LTG和内标在 207 nm 紫外吸收波长下响应最强，无内源性干扰。方法学验证结果显示，本方法的选择性较好，不受其他内源性物质的干扰，空白基质干扰小，残留结果符合要求；LTG在1.18～37.75 mg·L-1范围内线性关系良好(r=0.999)，在定量下限、低、中、高浓度批内与批间RSD均小于13.2%，样本适应性好，不同储存条件下LTG结果稳定，这与其理化性质稳定有关，能确保测定结果反映患者采样时的分析物浓度，可以满足所有临床样本的检测需求。本方法仅需150 μL血清样本，可实现小样本准确测定药物水平，适合临床常规LTG药物浓度监测，有利于基层医院送检样本的集中处理。

综上所述，本研究建立了分析速度快、操作简便、选择性好、准确度高、符合生物样品分析要求的测定LTG临床血药浓度的HPLC分析方法，有助于达到临床精准治疗。