固相微萃取-气相色谱法结合感官评价建立液态乳在物流中酸败的预测方法

杨帅，陈成，郭晓雅，程蕾，车会莲

（中国农业大学特殊食品研究中心食品科学与营养工程学院，北京 100083）

0 引 言

随着人民生活水平日益提高，液态乳制品逐渐成为人们日常生活中的重要成分。液态乳制品中的游离脂肪酸作为乳制品的风味物质，对其品质有重要影响[1]。但是在生产加工、物流过程中液态乳受外界环境的影响会导致营养成分发生改变，牛奶中固有的或由噬冷微生物产生的脂肪酶释放游离脂肪酸（FFA），使牛奶中产生酸败、苦涩和不愉快气味[2]。短链游离脂肪酸（主要是C4-C12）是酸败风味的主要成分，而长链游离脂肪酸（C14-C18）与酸败不相关。

对于液态乳制品脂肪酸检测方法主要有气相色谱法[3]、高效液相色谱法[4-6]、滴定法、微生物检测器检测和固相微萃取-气质联用法[7-9]等等，其中气相色谱法应用最广泛。用气相色谱法测定奶中脂肪酸时，通常采用衍生化方法，将脂肪提出后对脂肪酸甲酯化用气相色谱仪分析[10]。但衍生化方法对测量奶中FFA时，短中链脂肪酸具有挥发性或半挥发性，易挥发影响测定结果。顶空固相微萃取-气相色谱质谱法联用（HS-SPME-GC/MS）技术以其快速、方便、高效的优点，成为液态乳制品中游离挥发性物质的常见定量检测方法[11-12]。固相微萃取（HS-SPME）技术是一种无溶剂，集采样、萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新技术，结合气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）可以实现对液态乳制品中风味化合物的定量分析[13-14]。固相微萃取、气相色谱等技术联用可检测香精[13]、羊奶[15]、茶叶[16]、花椒[8]、化妆品[17]中挥发性成分，在环境（农药残留[18-19]）、石油等领域也有应用。但在检测液态乳游离脂肪酸时由于沸点低，在液态乳制品中含量少，在极性萃取头上吸附能力相对较弱，影响萃取效率，而且SPME-GC/MS一般使用峰面积归一法进行半定量，得到的数据只是目的脂肪酸占所有风味物质的百分比，是一个比例数据，限制了方法的准确性与精密度[20]。

牛奶味道温和，任何异味的存在都很容易影响其原本的味道，为了避免物流过程中环境或人为原因导致牛奶发生异味，需要一种方便精准的检测程序，在液态乳产生异味之前测量其风味前体、风味成分等可能引发异味的风险因素。本研究利用固相微萃取和气相色谱技术与感官评价结合建立了酸度值（ADV），FFA浓度和感官之间的联系，通过逐步多元回归分析，将定量感官数据与牛奶中单个短链FFA（C4-C12）相关联，建立检测和预测液态乳制品物流过程酸败的分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

游离脂肪酸标准品（丁酸，己酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，十四烷酸和十六烷酸），购自Sigma；生牛奶,来自某奶牛场；市售的四个不同液态乳制品品牌的含3%脂肪的19种商业巴氏灭菌均质乳制品，并保持在4℃。

1.2 仪器设备

固相微萃取器，其中萃取头为50/30UM DVB/CAR on PDMS,购于美国Supelco公司；GC5400气相色谱仪；深圳天瑞ROHS仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牛奶样品的制备

将新鲜的巴氏灭菌奶5℃下孵育24 h以使酸败发生。生奶在66℃下分批巴氏灭菌35 min，并迅速冷却。将分批杀菌的生奶样品在不同的小瓶中冷冻直到用于分析。通过将生奶的等分试样与高品质的新鲜巴氏消毒奶（5∶95，10∶90，15∶85，20∶80，25∶75，30∶70，35∶65，40∶60，45∶55和50∶50）混合制备具有不同酸度强度的样品。根据感官和分析测试的要求制备混合物。通过混合两种不同批次的脂解生奶和在四种不同场合收集的高品质新鲜巴氏消毒牛奶，共制备了40个酸败样品。另外还分析了6个高品质新鲜巴氏消毒均质牛奶样品。因此，共对46个样品进行化学和感官分析。

1.3.2 感官评估

挑选了12名感官评审员，均为非吸烟的正规牛奶消费者，从12名初级评委中选出了5名评审小组成员。他们是四位女性和一位男性，年龄在25至46岁之间。小组成员的敏感性是通过测试其区分牛奶酸度的能力进行确定的。五名小组成员确定牛奶酸败的绝对或感官评价阈值。对应于感官评价阈值的奶被标记为特殊腐败酸奶，并且在训练和感觉测试期间用来作为参考样品。根据限制的方法，当50%的评委同意给一个样本同样的感觉时，就确定了检测阈值。当用新鲜的巴氏灭菌均质牛奶中15%制备的生奶样品增加酸度，感官评审员品尝出酸味，那就说明用新鲜的巴氏灭菌均质牛奶中15%制备的生奶样品是引起酸败所需的水平。

培训的开始时先确定酸败强度规模和参考标准的使用规则，用10分酸度强度量表进行感官分析（从0=不可察觉到10=非常显著）。用于培训和测试的样品是如上所述制备的具有不同酸度强度的牛奶。在每个测试期间，小组成员都获得了三个参考样品，一个高质量的新鲜牛奶，一种特异的酸奶（15∶85），其对应于绝对或检测阈值，以及极酸性牛奶（50∶50）。小组成员在品尝不同样品之间用水漱口，并以自由选择的方式食用无盐饼干，以清除口感。参考样品的顺序依次为0.0（新鲜牛奶），3.0（明显的酸奶）和10.0（极酸性牛奶）。感官评分从0到2.9的样品依次为∶非乳清乳，而得分≥3.0的样品为酸奶。

1.3.3 固相微萃取-气相色谱法

FFA通过SPME-GC分析测定了40个生奶样品中的FFA，6个高品质新鲜巴氏消毒奶样品和19个商业巴氏消毒奶样品。在密封的小瓶中，通过放置40 mL含有28%NaCl和戊酸，pH 1.5的酸（20ppm）作为内标牛奶收集挥发性，70℃平衡30 min，并将聚丙烯酸酯纤维暴露60 min，小瓶顶空。当用硫酸将p H调节至1.5时，短链FFA释放到顶部空间。吸附在纤维上的FFA在GC5400气相色谱仪解析5 min，DB-FFAP毛细管柱分离。通过分析标准对样品进行初步鉴定。将新鲜的巴氏消毒牛奶储备溶液（20 000 ppm）掺入FFA分析标准品中，制成终浓度为10，20，40和100ppm，构建标准FFA的校准曲线。测定40个生奶样品、6个高品质新鲜巴氏消毒匀浆乳制品和19个商业巴氏杀菌匀浆乳制品的ADV值，每个样品重复测定三次。

1.3.4 统计分析

使用Systat/Sygraph逐步多元线性回归将实验室制备的具有不同酸度的46个样品的FFA和相应的酸败风味强度数据进行回归分析，因变量是感官评审的酸败风味强度得分，自变量是FFA的浓度，以百万分之一为单位。牛奶样品类似地，ADV作为独立地依赖变量和log（RSobs）分别进行回归分析其相关性，并将该方程与FFA基本方程进行比较。为了评估进行预测的回归模型的准确性，计算了19个商业乳制品的检测值和预测值之间的差异。

2 结果与分析

2.1 感官评价的准确性

新鲜牛奶的ADV为0.6，在正常牛奶报告的范围内（ADV＜0.7）。酸奶（绝对检测阈值）的ADV为2.1。感官训练是在正式测试之前，进行22次的训练测试。通过将生奶的等分试样与新鲜的巴氏消毒的均质牛奶（0∶100,10∶90,15∶85,25∶75,35∶65和 50∶50）混合，制备了六种样品，并进行编号，每个样品重复三次，然后对其进行方差分析（表1），以确定评估小组和样本之间的显着差异。小组成员之间没有显着性差异（p＞0.01），表明感官评价结果稳定可靠（表1）。

表1 感官小组成员评估方法分析总结

2.2 短链脂肪酸浓度与酸度感官评分显著相关

分析SPME-GC检测的FFA的含量与经过训练的感官小组评估的酸败评分之间的关系。实验室制备的不同程度酸败的46个样品的数据生成的回归模型由下式表示：

感官评价小组确定的牛奶酸度与样品中FFA的浓度呈正相关（p＜0.001，相关系数为0.84）。测量19种商业液态乳制品的FFA浓度，并使用方程式1计算预测的酸度分数。根据感官分数对应，18个样品被归类为非酸败奶，因为它们的分数对应于新鲜，非酸性牛奶的特征范围（0～2.9），只有样品19被分类为明显的酸败奶，因为它对应感官评分3.0（表2）。通过基于FFA的模型预测感官评分时，测试的19个样本的风味分类与感官评估的酸败分数分类达成100%一致。将18个样品分类为非酸败奶，范围为0至2.9，样品19分类为明显的酸败奶，分数为3.0（表2）。在这项工作中，发现游离脂肪浓度与酸度感官评分之间存在着十分显著的相关性，也显示了单个脂肪酸或脂肪酸组之间的相关性较低。可能是由于FFA没有完全回收，因为FFA的回收率取决于p H值，1.3至3.0之间的低p H值来回收短链（C4-C8）脂肪酸。改变pH值的可以提供更佳的短链脂肪酸的回收率，并且与腐败风味具有更强的相关性。

2.3 ADV值和酸度感官评分存在相关性

该模型中使用的46种牛奶样品的ADVs范围为0.6至4.08，与观察到的酸败分数（1.6～8.7）相对应。为了确定这46个ADV数据与观察到的酸败评分（RSobs）之间的关系，生成了一个回归模型，并拟合成(2)式。

表2 商业奶的游离脂肪酸(FFA)数据和酸度值（ADV）的方程的预测能力

对于该模型，获得了两者的相关系数为0.79，有显著性意义（p＜0.001），表明由感官感知确定的牛奶酸度与ADV值相关。由于ADV＞1.0的奶是酸败的，如果仅用ADV值对商业奶的风味进行分类，则除了样品4和16之外，所有样品都将分类为酸败奶，因为它们的ADV值均大于1.0。因此，在进行酸败评价时必须进行感官评估，以确认在具有高ADV的牛奶样品中存在酸败味，而仅根据其ADV没有将其分为酸败奶。

虽然ADV值和酸度感官评分之间存在高度相关性，但也存在差异，这些差异可能是由于脂肪酶释放FFA的原因，来自生奶中甘油酯的脂肪酸水解主要是由加入均质乳制品中的乳脂肪酶引起的。

4 结论

本研究建立的分析方法在乳品行业中可用于检测和预测物流过程中液态乳制品的酸败情况。基于测定短链游离脂肪酸的技术与酸败风味高度相关，通过固相微萃取气相色谱测定液态乳中短链游离脂肪酸与经过训练的感官小组测定的风味评分结合检测乳制品的酸败情况，对于所测试的样本，预测准确率为100%。但是仪器方法的校准需要进行感官评估，一旦建立了数学模型，即能简单、快速、准确对未知样品进行客观评估，而不需要感官评审人员的感官评价。该分析方法为乳制品质量控制与检测提供了有效的途径。