基于荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方羊奶粉中牛源性成分

郦娟，董华夏，张珣，曾慧君，戴小芳，向春燕，杨永

（武汉食品化妆品检验所，武汉 430012）

0 引 言

羊乳具有优越的营养价值、易于吸收，在部分欧洲部分国家被视为营养佳品。欧洲鲜羊奶的售价是牛奶的好几倍[1]，虽然羊奶在国内产销的市场份额比较小，但是羊奶粉的价格普遍高于牛奶粉。在经济利益的驱动下,羊乳中掺入牛乳的现象时有发生，且呈现日趋严重的趋势。这不仅制约了羊奶产业的良性发展,更有可能威胁到消费者的生命安全。羊乳中αs1-酪蛋白含量远低于牛乳[2]，而αs1-酪蛋白被认为是牛乳主要的过敏原[3]。很多消费者选择羊乳是因为对牛乳过敏，若在羊乳中掺杂牛乳，对牛乳过敏人群误食有可能会威胁生命。

2016年10月实施的《婴幼儿配方乳粉产品配方注册管理办法》在其第三章第三十一条中，明确规定了“产品名称中有动物性来源的，应当根据产品配方在配料表中如实标明使用的生乳、乳粉、乳清(蛋白)粉等乳制品原料的动物性来源”[4]。从保障我国消费者权益与食品安全，以及加强我国食品安全监管部门的监督能力的角度出发，婴幼儿配方羊乳粉中牛源性成分的快速检测方法的建立具有重大意义。目前的检测方法多是基于羊乳和牛乳中蛋白质的差异，比如等电点聚焦电泳[5]、高效液相色谱技术[6]、酶联免疫等[7]。由于乳粉生产工艺复杂，要经过高温过程，蛋白质性质会发生改变，再加上方法操作复杂，对人员要求较高，使得这些方法在日常检测中的应用受到限制。

本方法通过比较几种乳粉DNA抽提方法，分别以线粒体DNA的细胞色素氧化酶b亚(Cytb)和线粒体DNA12SrRNA为目标基因，以荧光定量PCR方法鉴别婴幼儿配方羊奶粉中牛源性成分。最终建立以线粒体DNA12SrRNA为目标基因，用荧光定量PCR的方法鉴定婴幼儿配方羊奶粉中牛源性成分的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：不同品牌婴幼儿配方牛乳粉和羊乳粉（后文简称牛乳粉和羊乳粉），作为引物及探针特异性检测用的小麦、腰果、榛子、燕麦、牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉均为市售。

主要试剂：细胞组织基因组DNA提取试剂盒（天根），磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工），柱式深加工产品基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）、2×Taq PCRmix。

1.2 主要仪器

微量核酸蛋白质定量仪(Nanodrop ND2000)，荧光定量PCR仪(BIO-RAD CFX 96 TOUCH)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

样品前处理。称取乳粉100 mg，加入600μL dd H2O进行充分溶解，混匀，13 000 rpm/min离心5 min，用灭菌枪头小心去除上层脂肪层和上清液，留下沉淀。后续操作按照各抽提试剂盒说明书进行，细胞组织基因组DNA提取试剂盒方法称为方法1，磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒称为方法2，柱式深加工产品基因组DNA抽提试剂盒成为方法3。

1.3.2 DNA浓度检测

将提取得到的DNA用微量核酸蛋白质定量仪测量OD值，若OD260／OD280介于1.8至2.0之间，DNA浓度达到50～200ng/μL则可满足试验要求。

1.3.3 荧光定量PCR检测

引物和探针。通过查阅资料和BLAST比对确定引物及探针，包括针对牛和羊线粒体DNA细胞色素氧化酶b亚基的bovine-cytb和goat-cytb、针对牛和羊线粒体DNA12SrRNA的bovine-12SrRNA和goat-12SrRNA引物探针组合，具体见表1。

反应参数如下。

bovine-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman引物探针组合的荧光定量PCR反应参数：95℃3 min，1个循环，95℃15 S，60℃1 min，40个循环，同时收集荧光。反应体系：模板DNA100 ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探针1μL（10 μmol/L），加无菌双蒸水补足至25μL。同时设置反应试剂空白对照（以水代替模板DNA）和阳性对照。

bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNATaqman引物探针组合的荧光定量PCR反应参数：95℃2 min，1个循环，95℃15 S，60℃30 s，40个循环，同时收集荧光。反应体系：模板DNA100ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探针1μL（10μmol/L），加无菌双蒸水补足至25μL。同时设置反应试剂空白对照（以水代替模板DNA）和阳性对照。

表1 各种成分检测引物与探针序列

2 结果与分析

2.1 引物探针的特异性

以牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、玉米、腰果、榛子、燕麦DNA为模板，用bovine-cytb-Taqman、goat-cytb-Taqman、bovine-12SrRNA-Taqman和 goat-12SrRNA-Taqman分别进行扩增，goat-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman只对羊肉DNA有扩增，bovine-cytb-Taqman和bovine-12S rRNA-Taqman只对牛肉DNA有扩增，说明扩增均具有特异性。

2.2 不同方法抽提乳粉DNA结果

将用不同试剂盒法提取好的牛乳粉的DNA稀释10倍，使用核酸蛋白浓度测定仪对样品DNA进行测定，按照bovine-cytb-Taqman方法检测牛源性成分检测，具体结果见表2。

表2 不同方法提取牛乳粉DNA质量结果

根据4个乳粉样品的检测结果可见，本实验中方法1和方法2抽提牛乳粉DNA的效果好于方法3。用方法1和方法2抽提羊乳粉DNA，按照goat-cytb-Taqman方法检测羊源性成分检测，具体结果见表3。

表3 不同方法提取羊乳粉DNA质量结果

可见，方法1抽提乳粉DNA的效果比方法2和3好，按照方法1进行后续乳粉DNA抽提。

2.3 荧光定量PCR方法灵敏度比较

以bovine-cytb-Taqman和 bovine-12SrRNATaqman方法扩增同样的牛乳粉DNA，比较两种方法的Ct值，结果检表4。

以goat-cytb-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法扩增同样的羊乳粉DNA，比较两种方法的Ct值，结果检见表5。

表4 两种乳粉中牛源性成分检测方法灵敏度比较

表5 两种乳粉中羊源性成分检测方法灵敏度比较

可见，以bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法检测乳粉中的牛和羊源性成分，具有较高的灵敏度。

2.4 实际样品的检测

收集20份婴幼儿配方羊乳粉。采用前述方法1抽提DNA。以goat-12SrRNA-Taqman方法鉴定乳粉中羊源性成分，以bovine-12SrRNA-Taqman方法鉴定乳粉中的牛源性成分。

2.4.1 判定标准

若目标成分检测结果Ct值≤30.0，判定为检出相应成分。若目标成分检测结果Ct值＞30.0，判定为未检出相应成分。

2.4.2 样品检测结果

20份婴幼儿配方羊奶粉中均检出羊源性成分，2份未检出牛源性成分，18份检出牛源性成分（见表6）。

3 结 论

乳粉的加工过程复杂，还含有脂肪等很多其他成分，而得到高质量的DNA是利用荧光定量PCR方法进行成分鉴定的重要前提。这使得鉴定乳粉中的源性成分比鉴定鲜乳中的源性成分困难[8]。通过比较，发现将去脂肪的前处理步骤与现有商品化试剂盒抽提方法结合起来，可以快速简便得到满足荧光定量PCR检测要求的DNA。

本研究以牛、羊线粒体DNA 12SrRNA为目标基因，建立了快速检测婴幼儿配方羊乳粉中牛源性成分的荧光定量PCR方法。对20个婴幼儿配方羊奶粉进行检测，结果仅有2个样品为纯羊奶粉，18个样品检出牛源性成分。而18个检出牛源性成分的婴幼儿配方羊乳粉中仅有2个在标签标识中标明了其脱盐乳清粉和乳清蛋白粉为牛源性，其余样品未标识源性。

羊乳粉中掺入牛源性成分，一般分为两种情况，一是直接添加牛乳粉，一种是以牛乳清粉代替羊乳清粉掺入羊乳粉。牛α-乳白蛋白、牛β-乳球蛋白可以作为鉴别羊乳粉中是否添加牛乳清蛋白的标志物。目前正在尝试以牛α-乳白蛋白和牛β-乳球蛋白为目标基因，用荧光定量PCR的方法检测是否是由于牛乳清蛋白的掺入造成的。今后从α-乳白蛋白和β-乳球蛋白入手，可以进一步分析出羊乳粉是如何掺入牛源性成分，更利于监管工作。

表6 婴幼儿配方羊乳粉实际样品检测结果及标签标识信息