当归挥发油对人肺腺癌GLC-82细胞增殖及细胞周期的影响*

张正顺 ，张艳霞 ，陈绍仪 ，孔学礼 ，周佳玮

1甘肃省中医院白银分院，甘肃 白银 730900；2甘肃中医药大学/甘肃省中药药理与毒理学重点实验室/甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室；3白银市第二人民医院

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，为常用中药，具有调经止痛、补血活血、润肠通便之功效［1］。现代药理研究表明当归的有效成分有抗肿瘤作用，但当归提取物对肿瘤细胞生长的影响报道显示不一致，甚至有作用相反的研究报道，台湾学者Chang等［2］研究发现当归中提取的阿魏酸具有促进MCF-7细胞生长的作用。Kim等［3］研究发现当归的呋喃类化合物体外具有抑制A549、SK-MEL-2等细胞生长的作用。朱晓音等［4］研究发现当归水提物有刺激人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的作用。而当归挥发油能够明显抑制人宫颈癌HeLa细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖。这些结果提示当归中不同提取成分对肿瘤细胞生长的影响可能不同，甚至相反。当归中主要成分之一当归挥发油对肺癌细胞的生长及周期是否有作用，目前尚不确定，本研究采用噻唑蓝（MTT）法研究当归挥发油对人肺腺癌GLC-82细胞的细胞毒作用，并应用流式细胞术检测其对细胞周期的影响，初步探讨当归挥发油对GLC-82细胞增殖及周期的作用。

1 材料与方法

1.1 试验药物 当归挥发油由岷县康达药业开发有限责任公司提供，制备方法为称取当归饮片1 kg，应用置超临界萃取设备进行CO2超临界流体萃取，CO2流量 2 L/（kg·h）、压力 25 MPa、萃取温度40℃，时间6小时，所得当归萃取液过滤，滤液静置后取油层，得8.2 g挥发油，当归挥发油含量为每100 g药材含0.82 g，所得当归挥发油经GC-MS分析，藁本内酯含量为81.4%。卡铂注射液（齐鲁制药有限公司，批号：WB1J1402001，规格：50mg/10mL）。

1.2 试剂 胎牛血清 FBS Premium，cat.No：P30-3302，Lot.No：P1410047（杭州四季青生物工程有限公司产品，批号：140126）；RPMI 1640培养基（Gibco Invitrogen Corporation，U.S.A.产品）；噻唑蓝（MTT，Solarbio 公司产品，Lot.No.3D3H0511，Exp.20200617）；胰酶细胞消化液（Biosharp 公司产品，产品编号：BL512A）；十二烷基硫酸钠（SDS，solarbio 公 司 产 品 ，Lot.NO.325E035）；双 抗（Beyotime 公司产品，编号：C0222）；磷酸盐缓冲液（PBS，0.006 7 M，Hyclone 产品）；细胞周期试剂盒 （#CCS012 Cell cycle staining kit，LOT#：6223805，联科生物产品）。

1.3 细胞系 人肺腺癌GLC-82细胞购自中科院上海细胞生物研究所细胞库，由兰州大学基础医学院药理学研究所传代保种。用含10%小牛血清及含1%双抗（1×105IU/L青霉素和1×105IU/L链霉素）的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下在培养箱中培养，本细胞为贴壁细胞，传代时用0.25%胰蛋白酶消化液消化，2～3天传代1次。

1.4 仪器 MCO-15AC型CO2培养箱（日本三洋科研医疗设备公司产品）；HF safe 760S型超净工作台（香港力康仪器有限公司产品）；Epoch型全波长酶标仪/超微量微孔板紫外分光光度计（Bio-tec公司产品）；流式细胞仪（BD FACSVerseTM流式细胞仪，USA产品）；IX71-22PH型倒置显微镜（OLYMPUS产品）；80-1型离心机（金坛市恒丰仪器厂）；GR60DR型全自动高压灭菌器[致微（厦门）仪器有限公司]；PB-21型PH计（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 M TT法测定当归挥发油对人肺腺癌G LC-82细胞增殖的抑制作用 取对数生长期GLC-82细胞，制备细胞浓度为1×105/mL的细胞悬液，以90 μL/孔加入96孔培养板中。实验分空白对照组、阴性对照组、当归挥发油系列浓度（6.25、12.5、25、50、100、150、200 μg/mL）组及相应的颜色对照组。培养24小时后细胞贴壁，加入药物（10 μL/ 孔），继续培养44小时，加入MTT（10μL/孔），再培养 4小时后加入 10%SDS（100 μL/ 孔），置培养箱中过夜，次日于波长570 nm处测定吸光值。计算当归挥发油对GLC-82细胞的抑制率（IR），公式如下：

1.5.2 倒置显微镜观察细胞生长形态 取对数生长期的GLC-82细胞，制备浓度为1×105/mL的单细胞悬液，接种于培养瓶内，分阴性对照组、当归挥发油（25、50、75、100、200 μg/mL）组。培养 24小时待细胞贴壁后，分别以每瓶1 mL加入药物或生理盐水，继续培养48小时。于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.5.3 流式细胞仪检测细胞周期 取对数生长期的GLC-82细胞，调节细胞浓度至1×105/mL，以每瓶9 mL接种100 mL容量的10个培养瓶内，分别作为阴性对照组及当归挥发油25、50 μg/mL浓度组。培养24小时待细胞贴壁后，分别以每瓶1 mL加入药物或生理盐水，继续培养48小时。实验终止时收集细胞沉淀，然后按下述步骤操作：1）用预冷的PBS洗1遍，离心，弃去上清；2）加入1 mL的DNA染色液和10 μL的破膜剂，涡旋混匀5～10秒。室温孵育30分钟。3）流式分析：孵育完的细胞悬液直接上机。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用t检验，MTT 测定中半数抑制浓度（IC50）用Curve Expert 1.3软件做曲线回归计算，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 当归挥发油对人肺腺癌G LC-82细胞增殖的抑制作用 当归挥发油对GLC-82细胞的增殖具有抑制作用，在浓度为6.25～200 μg/mL的剂量范围内呈浓度依赖性。当归挥发油对GLC-82细胞的IC50为 113.03 μg/mL，见表 1。

表1 培养48 h当归挥发油对G LC-82增殖的抑制作用（±s）

表1 培养48 h当归挥发油对G LC-82增殖的抑制作用（±s）

注：与阴性对照组比较，*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01；每板各浓度设3个复孔，为1次实验数据

组别 例数 剂量/（μg·m L-1） O D值 IR/%阴性对照组 4 0 0.58±0.09 -6.25 0.53±0.00 0.59±0.12 12.5 0.56±0.08 4.44±2.92 25 0.55±0.09 6.62±2.81当归挥发油组 4 50 0.47±0.13 20.12±14.40 100 0.36±0.10*36.74±23.02 150 0.14±0.06**75.77±9.39 200 0.06±0.04**89.81±4.79

2.2 倒置显微镜观察G LC-82细胞生长形态 阴性对照组GLC-82细胞结构完整，生长旺盛，折光率较高，胞体大，形态多边形，胞质均匀透明，随培养时间延长后形态无明显变化。当归挥发油处理后细胞形态发生改变，细胞结构逐渐固缩变圆并与周围细胞分离，折光率减弱，贴壁细胞减少，部分细胞脱落悬浮于培养瓶中，部分细胞裂解。随着药物浓度的增加，细胞皱缩越明显，死亡细胞逐渐增多。浓度为200 μg/mL时已经没有形态完整的贴壁细胞，细胞多呈亮色圆形漂浮在培养液中，见图1。

图1 当归挥发油对G LC-82细胞形态的影响

2.3 当归挥发油对不同细胞周期中G LC-82的影响 当归挥发油各剂量组与阴性对照组比较，G1期GLC-82细胞明显减少，G2期GLC-82细胞明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01），该变化呈浓度依赖性，见表2及图2。

表2 培养48小时当归挥发油对不同细胞周期中G LC-82细胞的影响（±s） %

表2 培养48小时当归挥发油对不同细胞周期中G LC-82细胞的影响（±s） %

注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

组别 例数 G 1 S G 2阴性组 3 64.66±1.15 23.54±1.35 3.53±0.70当归挥发油 25 μg/m L组 3 56.82±0.73** 24.67±2.13 13.32±0.09**当归挥发油 50 μg/m L组 3 45.89±1.88** 28.68±0.85 21.55±1.13**

图2 当归挥发油对不同细胞周期中G LC-82细胞的影响（48 h）

3 讨论

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率一直呈上升趋势，是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症，平均每30秒就有1 人死于肺癌［5］。肺癌是我国的第一大癌症［6］。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%左右，近年来，NSCLC治疗手段及化疗新药层出不穷，但疗效未得到进一步提高［7-8］，因此，推出高效低毒的新化疗药物是提高疗效的关键。近年来，随着中医药治疗肿瘤的不断发展，越来越多的中药提取物对肺癌细胞生长的抑制作用得到肯定，中药单药有效成分的研究成为热点［9］，例如，Xie 等［10］研究发现，茯苓皮提取物丹参酮ⅡA可诱导细胞凋亡和周期阻滞；王家晓等［11］研究发现，人参皂苷Rg3可明显诱导、提高荷瘤小鼠特异性抗肿瘤免疫反应；喜树果中含有的喜树碱、羟基喜树碱等对肺癌有显著疗效［12］；丹参中提取的丹参酮类物质对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，且可诱导肿瘤细胞凋亡和分化［13］；山豆根中含有的苦参碱等可抑制肿瘤细胞的核酸代谢［14］。本研究结果表明当归挥发油在浓度为6.25～200 μg/mL的范围内对GLC-82细胞的增殖具有浓度依赖性抑制作用，当归挥发油对GLC-82细胞的 IC50为 113.03 μg/mL。

肿瘤的发生是一个多因素、多步骤、多基因和多阶段改变的过程，其中细胞周期调控是肿瘤发生的重要机制［15］。本研究发现当归挥发油各剂量组G2期细胞较阴性对照组明显增多，且这种变化呈浓度依赖性。可以推断，当归挥发油可能通过阻滞细胞于G2期起到抑制GLC-82细胞增殖的作用。