高效液相色谱法测定益和长泰片中淫羊藿苷含量的研究

河南省口岸食品检验检测所（450003）魏华琳 李嘉 陶健

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、或朝鲜淫羊藿的干燥叶，淫羊藿苷是淫羊藿提取物，也是重要的有效成分[1][2]。现代药理研究表明，淫羊藿苷具有广泛的生理活性，能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还有补肾壮阳等功效[3]。

目前，淫羊藿苷的检测方法主要有分光光度法、薄层法、液相色谱法。为准确监控其含量，本文建立高效液相色谱法测定淫羊藿苷含量的方法。本方法简便，准确，重现性好，适用于益和长泰片中淫羊藿苷含量的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 ①仪器：高效液相色谱仪，美国waters公司，型号Waters e2695，Waters 2998 PDA检测器。水纯化系统，默克公司，Milli Q IQ7000超纯水仪。②试剂及耗材：淫羊藿苷标准品购自ChromaDex公司，批号：00009038-612。聚酰胺粉，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂，批号：2017年8月9日。甲醇，德国默克公司，色谱纯，批号：2020/04/30。无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司，分析纯，批号：2018年1月15日。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱Inertsustain C18 column（250mm×4.6mm,5μm)，柱温30℃，检测波长270nm，进样量10μL。流动相A：甲醇，B：水，等度洗脱条件见附表1。

1.2.2 样品处理 试样经过粉碎过后，称取0.50g（精确至0.01g）置于50mL离心管中，加入20mL70%乙醇水溶液，超声20min，涡旋1min，于4000r离心2min，上层清液全部转移到100mL梨形瓶，残渣再加10mL70%乙醇水溶液，涡旋1min，于4000r离心2min，合并上清液到梨形瓶中，在80℃旋转蒸发仪中蒸干，加10mL水溶解，待净化。取待净化溶液，过预先处理的聚酰胺柱，弃去流出液，加50mL水淋洗两次，弃去淋洗液；抽干小柱，加100mL乙醇洗脱，收集洗脱液（整个上样、洗脱过程保持流速1mL/min）到250mL梨形瓶中。在80℃旋转蒸发仪中蒸干洗脱液，用5mL甲醇溶解。经0.22μm滤膜重新过滤，供高效液相色谱测定。

附表1 流动相的洗脱程序

附表2 回收率试验结果

附图1 淫羊藿苷对照品溶液色谱图

附图2 样品溶液色谱图

1.2.3 标准曲线 用甲醇配制质量浓度分别为2μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的淫羊藿苷标准溶液，按色谱条件进行分析，记录色谱图，制作标准曲线。

2 结果

2.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器对淫羊藿苷对照品溶液进行全波长扫描，结果270nm处有最大吸收，最终确定检测波长为270nm。

2.2 色谱条件的选择 考察了不同比例的甲醇（35%～65%）流动相条件，结果表明，流动相为（甲醇：水=45+55）可获得更好的峰形和较高的响应值。附图1、附图2分别为对照品溶液及样品溶液的色谱图。

2.3 前处理方法的选择 样品经聚酰胺柱洗脱时，分段收集乙醇洗脱液（0～60mL，60～80mL，80～100mL，100～120mL）蒸干后，用甲醇定容进样。结果显示80mL醇洗液已经将淫羊藿苷完全洗脱，考虑到样品中淫羊藿苷含量的差异，最终确定乙醇洗脱液的用量为100mL。

2.4 方法的线性关系 将不同质量浓度的标准溶液上机测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归分析。结果表明，淫羊藿苷在2～100μg/mL范围内线性关系良好（r=0.9994）。

2.5 方法的检出限 对空白样品分别添加一定浓度的对照品溶液，使之在可以检出。按照信噪比为S/N=3计算，最低检出限为4μg/g。

2.6 精密度和回收率试验 采用空白样品进行回收率和精密度试验。样品中添加标准溶液，制成20μg/g、50μg/g、100μg/g三个添加水平，分别进行6次平行试验，平均回收率为98.5%，相对标准偏差（RSD）2.3%，符合试验对回收率和精密度的要求，见附表2。

3 结论

本方法通过对目标物的有效净化和分离，实现了快速测定，准确定量和确证的目的，适用于益和长泰片中淫羊藿苷含量的检测。