益气补肾方对自然流产小鼠Th17/Treg细胞及相关细胞因子的影响*

叶 平 叶 骞 胡蓝雅文 王欢欢 王百苗 董盼攀

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 浙江中医药大学第二临床医学院 浙江 杭州 310053

复发性流产(RSA)是指与同一性伴侣连续发生≥2次于孕龄为20孕周之前的妊娠物或胎儿丢失(体质量＜500g)[1]。生殖免疫学认为，母-胎免疫耐受微环境失调是复发性流产的重要影响因素[2]；Th17和Treg细胞分别作为调节性和效应性细胞，参与了妊娠的建立与维持。两者之间的免疫失衡可能导致妊娠失败[3]。益气补肾方为临床治疗RSA的有效自拟方，本团队前期药理研究发现，该方可调节自然流产模型小鼠CD4+/CD8+T细胞、CD28细胞及NK细胞的表达；增加孕早期及中晚期脾脏CD4+CD25+T细胞及Foxp3因子表达水平，并降低胚胎吸收率，但是否可调节Th17/Treg细胞免疫平衡，维持免疫耐受而改变妊娠结局尚未进行深入研究。对此，为进一步探讨其作用机制，本次研究采用自然流产小鼠模型，观察益气补肾方对妊娠结局、外周血Th17、Treg细胞含量、Th17/Treg细胞比例及相关细胞因子水平的影响，为益气补肾方防治复发性流产提供新的理论依据。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物：SPF级雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2小鼠16只、雄性BALB/c4只，体质量18～21g。雄性DBA/2小鼠购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-0016]，雌性CBA/J、雄性BALB/c小鼠购于北京华阜康生物技股份有限公司[SCXK(京)2009-0004]。

1.2 药物：益气补肾方组成：黄芪36g，菟丝子30g，白术18g，当归6g，党参、陈皮、升麻、柴胡各12g，中药购于浙江省中医院。制备：用8倍水浸泡，过夜，先煮沸30min，倒出药液，再加入8倍水，煮沸20min，最后再加5倍水，煮沸20min，合并药液并减压浓缩，最后配制成益气补肾方煎剂（含生药1.6g/ml），置－20℃冰箱备用。CsA溶液：由CsA胶囊(诺华制药，批号：S0340A；规格：25mg/粒)溶于0.1%浓度甲醇溶液[将0.1ml的无水甲醇溶于99.9ml的蒸馏水（避光保存）]制成。灌胃前2小时，将1粒CsA胶囊放入装有25ml 0.1%浓度甲醇溶液的小烧杯中，待胶囊软化后，用针头将其刺破，使内容物充分溶解于甲醇溶液，待用。

1.3 试 剂 ：CD4-FITC、PE-Cyanine5.5、IL-17A-PE、Foxp3 - APC、 RatIgG2aisoty Pecontrol-APC、RatIgG2aisoty Pecontrol-PE、Foxp3/Transcri Ption FactorStaining BufferSetKit均由eBiosci-ence公司生产。PMA/Ionomycinmixture、BFA/Monensin Mixture、Flowcytometry Stainingbuffer均 由 Liankebio公司生产。干扰素-ɣ（IFN-ɣ）、白介素-4（IL-4）、白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）均购于联科生物技术有限公司，批号为70-E-EK2022。

1.4 仪器：酶标仪（ThermoMultiskanMK3，美国）；流式细胞仪（FacsCalibur，美国BD公司）；台式高速冷冻离心机（德国EPPendorf公司，5417R）；漩涡混合器（XW-80A型，上海医科大学仪器厂）；细胞培养箱（上海跃进医疗器械厂）；低速自动平衡离心机（LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司）。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 造模、分组及给药：将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2∶1合笼，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c组），CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼，建立小鼠自然流产模型（CBA/J×DBA/2组）。每天17：30～18：00合笼，早上8：00～8：30检查阴栓，见阴栓日为妊娠第0天；未见阴栓，则继续合笼。每日测量孕鼠体重，观察腹部是否有明显隆起并及时排除假孕现象。最终，得到正常妊娠模型孕鼠6只，作为正常妊娠模型组（正常组）；自然流产模型孕鼠32只，取其中30只随机分为自然流产模型组（自然流产组）、环孢素组、中药高剂量组（高剂量组）、中剂量组、低剂量组，每组6只。分组完成后，正常组和自然流产组给予0.9%生理盐水10ml/kg；环孢素组给予CsA 10ml/kg；中药高、中、低剂量组分别给予48、24、12g/kg益气补肾方，连续2周，每天1次。

1.5.2 流式细胞检测外周血Th17、Treg细胞含量：连续给药14天后，摘眼球取外周血，置于肝素钠抗凝管中。取部分全血进行Th17、Treg细胞含量，Th17细胞抗体标记为FITC-抗CD4和PE-抗IL-17A，CD4+IL-17+表示为Th17细胞含量；Treg细胞抗体标记为FITC-抗CD4、PE-抗CD25、APC-抗Foxp3，CD4+CD25+Foxp3+表示Treg细胞含量，按照试剂说明书步骤处理完成后，上流式细胞仪进行检测。

1.5.3 酶联免疫法检测血清Th17/Treg相关细胞因子含量：剩余肝素钠抗凝管中的全血，2000r/min离心10min得到血浆。采用酶联免疫法检测IFN-ɣ、IL-17、IL-4、IL-10细胞因子含量，参照试剂盒说明书进行操作。

1.5.4 胚胎吸收率计算：末次给药取血完毕后，迅速处死小鼠进行解剖；用镊子撕开子宫，记录被吸收胚胎数和存活胚胎数。按下列公式计算胚胎吸收率：R=Re/(Re+F)×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎数，F表示存活胚胎数）。

1.6 统计学分析：采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理分析，计数资料用百分比表示，计量资料采用-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用方差分析，方差不齐时用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气补肾方对自然流产模型小鼠胚胎吸收率的影响：与正常组相比，自然流产组胚胎吸收率为25.0%；连续给药2周，与自然流产组相比，中药高、中、低剂量组均能显著减少胎盘吸收率（P＜0.05），增加胎盘存活数量；中药各剂量组间无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 益气补肾方对胚胎吸收率的影响（-x±s）

2.2 益气补肾方对自然流产模型小鼠Th17/Treg细胞的影响：结果提示，益气补肾方可影响自然流产模型Th17、Treg细胞含量，改善Th17/Treg比例失衡现象。见表2。

表2 各组孕14天小鼠Th17/Treg表达水平（-x±s，n=6）

2.3 益气补肾方对自然流产模型小鼠Th17/Treg相关细胞因子含量的影响：与正常组相比，自然流产组血浆IFN-ɣ含量显著升高（P＜0.05）；IL-4无显著变化（P＞0.05）。连续给药2周，与自然流产组相比，益气补肾方中药高、中、低剂量组均能显著降低自然流产模型小鼠IL-17、IFN-ɣ含量（P＜0.05）；中药低剂量组IL-10含量显著升高（P＜0.05）；中剂量组IL-4含量显著升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组孕14天小鼠Th17/Treg相关细胞因子含量表达水平（-x±s，ng/ml）

3 讨论

复发性流产归属于中医学“滑胎”范畴，主要病机为肾虚、脾肾两虚、血瘀、气血两虚等，而脾肾二脏亏虚是滑胎的关键，益气补肾方以补中益气汤为主方，结合经验方化裁而成，全方具有益气补肾、固摄安胎之效[4]。

生理水平的Thl7细胞具有显著促进胚胎成功着床的作用，Treg细胞抑制Thl7的炎症作用，但过多的炎症则导致着床失败和反复自然流产。因此，任何引起Thl7/Treg细胞比例失衡的因素都可能导致胚胎排斥的发生。有研究者报道，通过淋巴细胞免疫治疗后，可以使不明原因复发性流产患者外周血中的Treg细胞增加，而Th17细胞减少，从而改善患者体内免疫微环境，进一步有利于维持妊娠[5]。本实验结果显示，自然流产模型小鼠外周血Th17细胞明显升高，Treg细胞明显减少，Th17/Treg比值明显降低，与上述研究相一致。连续给药2周，益气补肾方可下调外周血中Th17细胞的比例，上调Treg细胞的比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移动而诱导免疫耐受。

Th17细胞通过分泌IL-17、IL-21、TNF-α、IL-22等，活化MAP激酶，诱导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-SCF)和IL-8募集中性粒细胞，直接参与慢性炎症反应，导致免疫排斥反应[6]。Treg细胞通过直接接触靶细胞或分泌抑制性因子如IL-10和TGF-β等抑制自身反应性T细胞的免疫效应，具有免疫无能及免疫抑制性，可降低母体对胚胎的排斥，维持免疫耐受。益气补肾方下调自然流产模型小鼠外周血中IL-17表达水平，上调IL-10的表达水平，推测益气补肾方通过调节Th17/Treg细胞比例，改变两者分泌细胞因子，进一步维持免疫耐受。

Thl主要分泌ɣ干扰素(IFN-ɣ)和IL等参与细胞免疫，而Th2主要产生GM-CSF、IL-4、IL-10和IL-13等参与体液免疫，Thl7/Treg细胞对可影响Thl/Th2细胞对的免疫功能加重免疫紊乱[7]。INF-ɣ能抑制GM-SCF在子宫内膜的分泌，从而抑制绒毛的生长，导致胚胎的吸收[8]，同时，高水平的INF-ɣ与高水平的NK细胞相关，NK细胞能非特异性地杀伤滋养层细胞[9]。本实验显示益气补肾方可降低自然流产模型小鼠外周血中IFN-ɣ水平，升高IL-4水平，推测益气补肾方可能通过影响IFN-ɣ和IL-4分泌，促进胚胎生长发育而影响妊娠结局。

本实验提示：益气补肾方可能通过调节Th17及Treg细胞的表达水平，降低Th17/Treg比例，并调节相关细胞因子的表达水平，影响Th17/Treg平衡，诱导妊娠免疫耐受，促进胚胎发育，从而改善妊娠结局。

4 参考文献

[1]中华医学会妇产科学分会产科学组.复发性流产诊治的专家共识[J].中华妇产科杂志，2016,51(1)：3-9.

[2]王松存，杜美蓉，李大金.母-胎免疫耐受研究进展[J].科学通报，2016,61(27)：2996-3001.

[3]王宁,姜凤良.Th1/Th2,Th17/Treg细胞与母胎免疫耐受和病理妊娠[J].中国免疫学杂志,2016,32(1)：136-139.

[4]李永丰，谢冬梅.补中益气汤治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J].浙江中医杂志，2015，50(1)：24.

[5]Wu L，Luo LH，Zhang YX，et al.Alteration of Th17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion before and after lymphocyte immunization therapy[J].Reprod Biol Endocrinol，2014，12（1）：74.

[6]Ouyang W，Kolls JK，Zheng Y.The biological functions of T helper 17 cell effector cytokines in inflammation[J].Immunity，2008，28(4)：454-467.

[7]张琚，杨菁.Th17/Treg免疫失衡与原因不明复发性流产关系的研究进展[J].生殖医学杂志，2015，24(11)：960-964.

[8]邵剑春，胡大春，陈俊，等.原因不明习惯性流产与细胞因子免疫平衡的相关性[J].检验医学与临床，2012，9(5)：568-569.

[9]Wang Y，Mei YH，Feng DC.Triptolide modulates T-cell inflammatory responses and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Journal of Neuroscience Research，2008，5(11)：3421-3425.