复方降糖颗粒剂的澄清工艺优化研究

王奥昉 赖 瑛

1 杭州电子科技大学 浙江 杭州 310018

2 浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

复方降糖颗粒剂为杭州市中医院临床验方，处方由黄芩、黄连、黄芪、山楂、茯苓和葛根6味中药组成，可适用于早期糖尿病脾虚痰湿及气滞痰阻证型患者[1]，在降低血糖、改善糖尿病症状等方面有显著的临床疗效。为了提高颗粒剂的质量、降低临床服用量，本实验对其壳聚糖澄清工艺进行研究，以浸膏粉吸湿性、黄芩苷和小檗碱的含量为指标，正交试验法对壳聚糖澄清工艺进行参数优化。

1 仪器、材料与试剂

高效液相色谱仪（ST1501，HPLC）；真空干燥箱（DZF-6050，北京永光明医疗仪器厂）；电子分析天平（FA1004，上海天平仪器厂）；紫外分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）；离心机（TGL205，长沙平凡仪器仪表有限公司）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110715-201117供含量测定用）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号110713-200911供含量测定用）；壳聚糖（浙江澳兴生物科技有限公司）；色谱乙腈、甲醇(色谱纯，Merck Company)，其余试剂为国药集团化学试剂公司的分析纯。中药材均从浙江中医药大学中药饮片厂购买。

2 实验方法

2.1 黄芩苷和小檗碱的含量测定：①色谱条件：色谱柱（Agilent TC-C18 250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.02M磷酸（三乙醇胺调pH至6.78）:乙腈:甲醇=（71:16:13）；检测波长：250nm；柱温：室温；流速：1ml·min-1；进样量20μl。②标准曲线的制备：精密称取105℃干燥至恒重的黄芩苷和盐酸小檗碱对照品20.08mg、3.920mg于25ml容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，得到含黄芩苷803.2μg/ml、含盐酸小檗碱156.8μg/ml的对照品溶液，分别取该对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别得到含黄芩苷8.032、16.064、32.128、48.192、64.256、80.32μg/ml，含盐酸小檗碱 1.568、3.136、6.272、9.408、12.544、15.68μg/ml的对照品溶液。照以上的色谱条件，分别精密量取各试液20μl注入液相色谱仪记录色谱图，见图1（A）。设进样浓度值为C，峰面积值为A，得黄芩苷一元线性回归方程：C＝0.0353A－3.397，r＝0.9999，线性范围 8.032～80.32μg·ml-1；盐酸小檗碱一元线性回归方程：C＝0.0155A+0.086，r＝0.9999，线性范围1.568～15.68μg/ml。③供试品溶液的制备：精密取含生药1g/ml的药液0.5ml，水浴蒸干后用80%乙醇15ml超声提取3次，每次提取1小时，然后将提取液过滤，将过滤后的提取滤液蒸干，用80%乙醇溶解，定容至10ml。取1ml于5ml容量瓶中定容至刻度，摇匀后再用0.45μm的水性滤膜过滤即得所供试品溶液。样品图谱见图1（B）。

图1 对照品和样品的HPLC色谱图

2.2 精密度试验：照上述色谱条件操作，取同一对照品溶液，连续进样测定6次，测得黄芩苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.64%，小檗碱峰面积的RSD为1.71%。

2.3 重复性试验：精密吸取同一批次的样品6份，按“2.1”项下方法制得供试品6份，在上述相同色谱条件下测定，结果黄芩苷含量平均值为4.02mg/ml，RSD为2.29%；小檗碱含量平均值为0.359mg/ml，RSD为2.06%。

2.4 回收率试验：分别精密量取已知黄芩苷和小檗碱含量的同一批样品溶液9份，每3份为一水平，分别精密加入一定量的黄芩苷和小檗碱对照品溶液（含量分别为 803.2μg/ml、156.8μg/ml）0.6、1、1.8ml，然后按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在同一色谱条件下进行进样测定，可得黄芩苷的平均回收率为95.45%，RSD为3.03%；小檗碱的平均回收率为83.13%，RSD为2.77%。

2.5 吸湿百分率的测定：取一定量的浸膏粉，放置于30℃烘箱中，恒重48h。用NaCl饱和溶液干燥器，48h后称量，按如下公式计算吸湿百分率[2]。试验做两组，取平均值。吸湿百分率=（吸湿后重量－吸湿前重量）/吸湿前重量×100%。

2.6 正交法优选壳聚糖澄清工艺：选取壳聚糖用量、药液浓度和温度因素设计L9（34）正交试验。见表1、表2。

表1 因素水平表

2.6.1 样品制备：按照正交试验所设计的条件，将提取液稀释加热后，缓慢加入壳聚糖胶体溶液，边加边搅拌，加完后再继续保温搅拌15min，然后冷却至常温，最后离心取上清浓缩定容至1g/ml，灌封，灭菌，即得。

2.6.2指标测定：吸湿性、黄芩苷、小檗碱，F0.05（2,2）＝19.00，自由度均为2。方差分析结果见表3。

表2L9（34）正交实验表

表3 方差分析结果

3 结果

3.1 因素比较分析：3个因素中，对吸湿性影响最大的是C因素，最佳水平是C2；对黄芩苷影响最大的是A因素，最佳水平是A1；3种指标中B因素的3种水平无显著性差异，直观分析结果显示，B因素的最佳水平均为B1。因此，A、C因素根据黄芩苷和吸湿性的方差分析结果，分别选A1和C2；C因素根据直观分析选B1；即优选出澄清工艺条件为壳聚糖用量占生药量的0.2%，药液浓度为0.2g/ml，加入时的温度为40～50℃。

3.2 优选工艺条件重复性试验：为验证上述优选的壳聚糖澄清工艺最佳条件的稳定性，取相同量的药液3份，按最佳条件A1B1C2操作，平行操作，结果吸湿性、黄芩苷、小檗碱的平均值分别为22.8%、3.606mg/ml、0.274mg/ml，RSD均小于3%。

4 讨论

复方降糖颗粒剂主要成分有黄芪甲苷、黄芩苷、小檗碱。黄芪甲苷由于在高效液相的紫外检测器中响应值太低，无法检测，因此本实验选用了黄芩苷、小檗碱为有效成分检测指标。壳聚糖是一种含氮阳离子碱性多糖，由于其在澄清吸附过程中较之传统的醇沉工艺有明显的优势，近年来在医药、食品等行业得到广泛关注[3]。本文通过正交试验法对复方降糖颗粒的壳聚糖澄清工艺进行了优选，以吸湿性、黄芩苷、小檗碱为分析评价指标，优选出最佳澄清条件，即壳聚糖用量占生药量的0.2%，药液浓度0.2g/ml，温度40～50℃，并按最佳工艺进行重复性试验，吸湿性小，稳定性优，有效成分损失少。

5 参考文献

[1]沈艳.唐红运用活血化瘀法治疗糖尿病经验[J].浙江中医杂志，2010，45（9）：640-641.

[2]王佩，刘晓昱，徐红.复方芪苓无糖颗粒剂成型工艺的研究[J].中华中医药学刊,2014，32（2）：353-356.

[3]罗世江.影响壳聚糖絮凝法澄清效果因素浅析[J].中国医药指南，2012，10（12）：455-457.