IL⁃21和IFN基因多态性与慢性乙型肝炎疗效血清学应答的关系

胡璇 叶俊钊 廖献花 邵琮翔 李福曦 钟碧慧

中山大学附属第一医院消化科（广州 510080）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）导致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B）的发生，是肝硬化甚至肝癌的主要病因，造成严重后果。乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）血清学转换能够改善HBV感染免疫调控，有效降低患者终末期肝病发生风险，是抗病毒治疗的重要目标[1]。研究证明白细胞介素⁃21（interleukin⁃21，IL⁃21）及其下游效应细胞因子干扰素⁃γ（interferon⁃γ，IFN⁃γ）能够有效抑制HBV复制，促进HBV感染患者抗病毒治疗的结局转归[2-3]。患者抗病毒免疫应答反应与自身遗传背景的相关性逐渐受到广泛关注与探讨，炎症性细胞因子基因多态性与HBV感染患者预后转归的关联尚不明确[4-5]。

本研究通过检测接受核苷酸类似物治疗的乙型肝炎患者IL⁃21及其受体和IFN基因特定位点基因多态性，分析它们与HBeAg血清学转换和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）下降幅度的关系，旨在明确特定位点基因多态性对慢性乙型肝炎疗效血清学应答的影响，为患者个体化治疗提供有力证据。

1 对象与方法

1.1 病例来源和诊断标准选取2015年1月至2017年12月中山大学附属第一医院消化内科门诊就诊的慢性乙型肝炎患者，根据我国《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）诊断标准[6]，符合口服核苷酸类似物抗病毒治疗指征，已接受规律抗病毒治疗3年以上，HBV⁃DNA＜100 IU/mL且剪切波弹性成像（shear wave elastography，SWE）检测值均小于10 kPa。入选病例共200例，按照治疗3年后是否发生HBeAg血清学转换分为HBeAg血清学转换组（转换组）和非转换组（对照组），其中转换组50例，对照组150例。排除标准：（1）其他病毒感染性肝病，胆道相关疾病，遗传代谢性肝病，自身免疫性肝病及终末期肝病等；（2）长期饮酒酗酒史（男 ＞40 g/d，女 ＞20 g/d，超过5年；或者2周内大量饮酒史，＞80 g/d）；（3）正在接受免疫调节治疗或干扰素治疗患者；（4）自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、甲状腺功能亢进等；（5）药物滥用；（6）妊娠或哺乳。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学指标空腹6～8 h无菌条件下采集静脉血并完成以下指标检测：血常规，常规生物化学指标包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素、白蛋白、血尿酸、血肌酐、尿素氮、空腹血糖、空腹胰岛素，乙肝血清学标志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb），HBV⁃DNA定量，甲胎蛋白（AFP）。

1.2.2 单核苷酸多态性（single⁃nucleotide poly⁃morphism，SNP）分型检测HapMap数据库中筛选IL⁃21、IL⁃21R和IFN尚未见文献报道或已在免疫方向文献报道较多的SNP位点，并选择等位基因频率＞0.05的多态性位点。最终遴选15个SNP位点（IL⁃21rs13143866，rs10032644，rs12505138，rs12508721，rs17005929，rs6840978，IL⁃21Rrs2214537，rs8057551，rs8061992，rs3093390，rs3093301，IFNA rs1831391，rs674189，IFNG rs7956688，rs2069705）采用Assay Designer 3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物。MassArray技术进行SNP分型检测。步骤如下：美国Agena公司基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI⁃TOF MS）对200个样本15个位点进行检测，经PCR扩增反应，产物碱性磷酸酶处理及单碱基延伸反应后，启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪芯片点样，MALDI⁃TOF质谱仪（MassARRAY Analyzer 4.0）分析点样后的芯片，TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计分析软件，正态分布数据采用均数±标准差进行统计学描述，非正态分布数据采用中位数及四分位数间距进行统计学描述。定量资料采用t检验或者非参数检验，定性资料采用卡方检验，基因频率及基因型频率采用卡方检验或者Fisher精确概率法，多元回归分析采用相对危险度（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence interval，95%CI）表示，哈迪-温伯格平衡（hardy⁃weinberg equilibrium，HWE）检测 采 用 SHEsis软 件（http：//analysis.bio⁃x.cn/my⁃Analysis.php）。所有数据均使用双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料共纳入临床资料完整的200例患者，其中转换组50例，对照组150例，两组间年龄、性别比较差异无统计学意义。转换组的HBsAg浓度水平、ALT水平和AFP水平均显著高于对照组（P值依次为0.012、0.010、0.035，表1）。

2.2 IL⁃21及其受体与IFN基因多态性预测HBeAg血清学转换分析SNP分型检测原始结果见图1。15个SNP位点中共发现7个HBeAg血清学转换阳性关联位点（表2），均具有群体代表性（基因型分布均符合HWE平衡，P＞0.05），分别是IL⁃21 rs12505138（A ＞G）等位基因A（36.0%vs.23.8%，P=0.017）及 AA基因型（14.0%vs.5.3%，P=0.045）、rs17005929（T ＞ C）等位基因T（35.0%vs.23.5%，P=0.024）、rs6840978（C＞ T）等位基因C（93.0%vs.83.9%，P=0.022）、IL⁃21R基因rs8057551（A ＞G）等位基因A（60.0%vs.46.0%，P=0.015）及 AA基因型（40.0%vs.22.1%，P=0.023）、rs8061992（C＞A）等位基因C（62.0%vs.47.7%，P=0.013）及CC基因型（44.0%vs.23.5%，P=0.027）、rs3093301（T＞C）TT基因型（34.0%vs.20.0%，P=0.043）和IFNA基因rs1831391（A ＞C）等位基因A（54.1%vs.41.2%，P=0.026）及AA基因型（26.5%vs.26.9%，P=0.026）在转换组中的频率均显著高于对照组。其中IL⁃21 rs12505138，rs17005929及IFNA rs1831391尚未见文献报道。

表1 转换组与对照组的基线资料Tab.1 Baseline characteristics of HBeAg seroconversion group and control group

图1 SNP分型原始结果Fig.1 The original results of SNP

2.3 HBeAg血清学转换阳性关联位点基因型与HBsAg下降幅度的关系200例患者中共126例继续原抗病毒药物治疗并随访至第48周（转换组42例，对照组84例）。在基线或随访第48周HBsAg比较发现，转换组相比对照组HBsAg水平明显更低（基线：3.25±0.62vs.3.52±0.66 Log10IU/mL，P=0.012，48周：3.06±0.79vs.3.41±0.67 Log10IU/mL，P=0.011），但基线至随访第48周的HBsAg下降幅度（△HBsAg）组间比较差异无统计学意义（0.11±0.28vs.0.11±0.20 Log10IU/mL，P=0.887）（表3）。而继续将△HBsAg与7个阳性关联位点基因型进行单因素和多因素分析比较发现，携带IFNA rs1831391CC基因型与HBsAg下降幅度独立相关（β=-0.200，95%CI：-0.122～-0.008，P=0.027），其他6个阳性位点与HBsAg下降幅度差异无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

流行病学调查结果显示我国普通人群HBsAg携带率为7%，HBV感染导致的终末期肝硬化和肝癌所占比例高达60%～80%，HBV的高度流行对家庭、社会乃至国家带来极大的经济压力与健康影响，造成严重的社会危害[7-8]。直接抗病毒药物即核苷类似物是现阶段慢性HBV感染患者的基本治疗药物，以往Ⅲ期临床试验数据提示，规律接受替诺福韦治疗患者第48周HBeAg血清学转换率为21%，恩替卡韦治疗患者第96周HBeAg血清学转换率为31%，而药物上市后实际数据显示接受治疗患者中HBeAg血清学清除率远未达到该比例[9-11]。

IL⁃21及IFN⁃γ是调节免疫应答过程中的重要细胞因子，其血清学水平也被证实与肝脏疾病的严重程度密切相关，已被认为是抑制HBV的重要分子[2，12]。一项纳入395例慢性HBV感染患者、75例HBV自愈和174例健康对照的研究发现，HBV感染患者携带 IL⁃21 rs2221903/IL⁃21R rs3093301 AA/CC基因型相比AA/CT或AA/TT基因型具有更高的IL⁃21及IgE水平，提示携带IL⁃21R rs3093301CC基因型在HBV感染中可诱导更高的IL⁃21及IgE水平继而影响HBV感染免疫状态[13]。

本研究以探讨HBV感染抗病毒治疗患者IL⁃21与IFN相关基因多态性与血清学应答的关联为目的，通过分析规律核苷酸类似物抗病毒治疗3年后实现HBeAg血清学转换患者（转换组）和尚未发生HBeAg血清学转换患者（对照组）数据发现，检测的15个SNP位点中共7个位点特定等位基因或基因型频率在转换组显著高于对照组，有助于预测HBV抗病毒治疗患者HBeAg血清学转换。其中有3个位点既往未见国内外的文献报道，分别为IL⁃21 rs12505138（A ＞ G）、rs17005929（T ＞ C）和IFNA rs1831391（A＞C），首次在中国汉族人群中检测出其单核苷酸多态性，为中国HBV感染患者抗病毒治疗提供了新的数据支持。此外，IL⁃21 rs6840978被证实是炎症性肠病的易感位点，并指出其与溃疡性结肠炎的发生密切相关[14]，而在HBV感染中未见相关报道，本研究结果提示携带rs6840978等位基因C患者相较于等位基因T患者经抗病毒治疗后发生HBeAg血清学转换率更高（93.0%vs.83.9%，P=0.022）。IL⁃21R rs8057551、rs8061992仅在一项白人受试者研究中发现其单核苷酸多态性与骨代谢相关，为骨质疏松症的发生提供了遗传学依据[15]。而本研究证实转换组中rs8057551（A＞G）等位基因A及AA基因型、rs8061992（C＞A）等位基因C及CC基因型频率显著高于对照组（均P＜0.05）。同时本研究发现IL⁃21R rs3093301 TT基因型相较于CC/CT在抗病毒治疗中患者实现HBeAg血清学转换的预测作用（34.0%vs.20.0%，P=0.043），该结果与前人报道结果一致[13]。

表2 IL⁃21及其受体和IFN基因HBeAg血清学转换阳性关联位点基因频率及基因型分布Tab.2 Allele and genotype frequencies of HBeAg seroconversion associated SNPs in IL⁃21，IL⁃21R and IFN gene例（%）

表3 转换组与对照组不同时期HBsAg及差值比较结果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

表3 转换组与对照组不同时期HBsAg及差值比较结果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

注：△HBsAg，HBsAg下降幅度

例数42 84组别转换组对照组P值HBsAg（Log10IU/mL）基线3.25±0.62 3.52±0.66 0.012 48周3.06±0.79 3.41±0.67 0.011△HBsAg 0.11±0.28 0.11±0.20 0.887

HBsAg清除亦是HBV感染抗病毒治疗患者临床疗效和随访过程中重点关注的方面，持续高水平的HBsAg浓度加剧患者肝脏相关事件的发生。本研究进一步将HBeAg血清学转换阳性关联位点基因多态性与随访48周HBsAg下降幅度分析发现携带IFNA rs1831391 CC基因型与HBsAg下降幅度独立相关，该结果为抗病毒治疗患者寻找临床治愈线索提供新的方向与思路。

本研究在中国人群检测发现7个HBeAg血清学转换阳性关联位点，其中包括3个国内外未见报道的新发现位点，2个与其他疾病相关但首次发现与HBV感染相关的位点，均有助于预测慢性乙型肝炎疗效血清学应答。本研究的不足之处有：（1）阳性位点的功能验证有待继续完善；（2）乙型肝炎患者治疗随访时间尚需适当延长以进一步验证疗效。本研究为在宿主自身遗传背景相关的IL⁃21及其受体和IFN特定位点SNP多态性与乙型肝炎治疗中患者抗病毒免疫功能及血清学清除的关系探讨方面提供了有力的证据支持，给乙型肝炎患者临床治疗领域带来新的理念和希望。