Hippo信号通路参与心肌缺血后适应的保护作用

周露 唐广胜 朱竑翊

1南京医科大学康达学院（江苏连云港222000）；2南京医科大学（南京210029）

目前，缺血性心脏病，如心肌梗死，在全世界范围内有很高的发病率和病死率。临床上，最快速有效的治疗方法就是及时恢复缺血区域的血供，而恢复血供会进一步引起心肌损伤，具体表现为心肌细胞死亡、心律失常、心脏功能障碍，最终导致心脏衰竭，引起严重后果，这种由缺血后恢复血供（即再灌注）引起的损伤，称为缺血再灌注（ischaemia/reperfusion，l/R）损伤[1-2]。但是，目前尚未有有效的治疗手段来对抗I/R损伤。2003年，ZHAO等[3]提出了缺血后适应（ischemic postcondi⁃tioning，IPostC）的概念，即在缺血组织得到再灌注之前采取短暂重复缺血、灌注处理，可以明显缓解氧化应激、抑制心肌细胞凋亡、降低梗死面积，从而对抗I/R损伤发挥心脏保护作用。然而，IPostC因其作用机制不清而在临床使用中受限。Hippo信号通路是新发现的，高度保守的生长控制信号通路，可以通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡调控器官发育和大小[4-5]。近年来，越来越多的研究发现Hippo信号通路在心脏发育、生长、再生甚至心血管疾病形成过程中发挥了重要作用[6-8]。既然Hippo信号通路参与心肌细胞增殖、凋亡过程，那么是否也参与了IPostC的心脏保护作用呢？至今尚未见报道。本实验将以Hippo信号通路中的核心分子，如MST（Mam⁃malian Sterile20⁃like Kinase）、YAP（Yes⁃associated protein）为研究对象，探讨该通路是否参与IPostC及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物出生1～3 d SD大鼠，购自购自南京医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（苏）2002⁃0031。

1.1.2 主要试剂DMEM（high glucose）、胎牛血清（美国Hyclone）；MTT、二甲基亚砜（美国Amresco公司）；MDA试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；Protein A/G PLUS⁃Agrose（美国Santa Cruz公司）；抗Bcl⁃xL抗体、抗Bax抗体、抗MST1抗体（美国BD Biosciences）；抗GAPDH 抗体、抗 p⁃MST1/2（Thr183/180）抗体、抗YAP抗体、抗p⁃YAP（Ser127）抗体（美国Cell Signal⁃ing）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG（巴傲得生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000（美国Life technologies）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞分离及培养取1～3 d的新生SD大鼠，酒精消毒后，用眼科剪取出心脏置于盛有预冷D⁃Hanks缓冲液的表面皿中，待洗净剪除其他组织后，转移到锥形瓶中，用手术剪将其剪成尽量小的组织块。使用胰酶分离乳鼠心肌细胞，然后采用Percoll梯度离心法提纯心肌细胞[9]。乳鼠心肌细胞使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱内培养。

1.2.2 细胞模型建立缺氧/复氧（H/R）细胞模型以及缺氧后适应（HPostC）模型按照之前的方法建立[10]。缺氧/复氧组细胞缺氧环境中培养3 h，正常氧环境继续培养6 h；缺氧后适应组细胞缺氧培养3 h后，正常氧环境继续培养5 min，然后迅速缺氧培养5 min，如此反复3次，将细胞置于CO2培养箱中正常氧环境继续培养6 h。

1.2.3 Si⁃RNA细胞转染取对数生长期细胞，离心后重悬于不含抗生素的细胞培养基中，以1×105/孔接种于6孔板中，细胞生长至融合率90%时进行转染。按说明书步骤使用LipofectamineTM2000进行转染。MST1⁃siRNA和阴性对照siRNA（NC⁃siRNA）由上海吉玛设计合成。MST1⁃siRNA正义序列：5′⁃CACTACAATATGAGCAGCAGCCAT⁃GGTT⁃3′，反义序列：5′⁃CCATGGCTGCTCATATTG⁃TAGTGTT⁃3′；NC⁃siRNA 正义序列：5′⁃CACAC⁃TATAAGCGGACCTAGATGTT⁃3′，反义序列：CATC⁃TAGGTCCGCTTATAGTGTGTT⁃3′。

1.2.4 细胞凋亡检测细胞模型建立后，将乳鼠心肌细胞消化、离心，PBS洗涤后，按照AnnexinV⁃FITC凋亡试剂盒的步骤进行操作，使用流式细胞仪进行细胞凋亡测定。

1.2.5 细胞活性检测使用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测。取对数生长期细胞接种到96孔板中，细胞贴壁后进行造模。每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入二甲基亚砜100 μL以终止反应，用酶标仪在570 nm波长处检测吸光度。

1.2.6 丙二醛（MDA）含量检测乳鼠心肌细胞造模后，消化离心得到细胞沉淀，使用细胞裂解液裂解细胞，1 600g离心10 min，取上清使用碧云天MDA试剂盒进行测定。

1.2.7 免疫共沉淀（CO⁃IP）造模完成的细胞消化离心后，提取蛋白并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，最终将各组蛋白浓度调整一致。加入要沉淀的目的蛋白抗体，4℃旋转过夜后加入40 μL琼脂糖珠，4℃旋转2 h后，离心弃上清，保留含免疫复合物的珠子。加缓冲液反复洗琼脂糖珠4次，加SDS上样缓冲液，混匀加热后进行SDS⁃PAGE电泳。

1.2.8 蛋白免疫印迹（western blot）造模完成的细胞消化离心后，提取蛋白质并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。加SDS上样缓冲液，混匀加热后取50 μg蛋白上样，进行SDS⁃PAGE凝胶电泳、转膜、封闭，依次加入一抗、二抗，加发光液后在显影仪上显影，使用ImageJ软件对条带进行灰度分析。

1.3 统计学方法利用SPSS 13.0统计软件进行资料分析，各组计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hippo信号通路参与HPostC保护作用通过检测细胞凋亡率、细胞活力、细胞MDA含量等指标发现，在转染MST1⁃siRNA细胞和转染NC⁃siRNA细胞中，H/R均明显增加了细胞凋亡率、降低了细胞活力，增加了MDA含量，而后适应能够削弱H/R所诱导的这些细胞损伤作用（表1、图1）。此外，通过计算（HPostC⁃H/R）/H/R表示转染不同siRNA细胞中HPostC保护作用的程度。如表1所示，转染了MST1⁃siRNA的细胞，在细胞凋亡率、细胞活力、细胞MDA含量中，其（HPostC⁃H/R）/H/R值均明显低于转染了阴性对照NC⁃siRNA的，说明MST1基因沉默使得HPostC的心肌保护作用减弱，因此，Hippo信号通路参与了HPostC的心肌保护作用。

表1 不同处理组的细胞凋亡率、细胞活力及细胞MDA含量（n=5）Tab.1 Apoptotic rate、survival rate and MDA level in cardiomyocytes with different treatment±s

表1 不同处理组的细胞凋亡率、细胞活力及细胞MDA含量（n=5）Tab.1 Apoptotic rate、survival rate and MDA level in cardiomyocytes with different treatment±s

注：H/R-缺氧/复氧处理组、HPost-缺氧后适应处理组；&P ＜ 0.05 vs.Control；*P ＜ 0.05 vs.H/R；#P ＜ 0.05 vs.（HPostC⁃H/R）/H/R in NS⁃siRNA cells

凋亡率（%）细胞活力（%）MDA[nmol/（L·mg protein）]NS⁃siRNA Control H/R HPostC（HPostC⁃H/R）/H/R（%）MST1⁃siRNA Control H/R HPostC（HPostC⁃H/R）/H/R（%）1.98±0.14 40.12±3.33&5.37±2.10*82.13±3.02 2.23±0.08 20.59±3.41&8.48±1.89*54.96±1.52#100 50.38±7.31&79.77±6.56*61.53±6.69 2.67±0.55 11.23±2.52&5.89±0.57*53.11±9.43 100 68.18±5.42&78.46±8.79 22.32±4.42#2.31±0.31 6.48±1.52&4.23±1.62 32.06±6.44#

图1 流式细胞术检测不同处理方式对乳鼠心肌细胞凋亡率的影响（n=5）Fig.1 Apoptotic rate in neonatal rat cardiomyocytes with different treatment using the flow⁃cytometer

2.2 HPostC影响MST1、YAP磷酸化水平 为了探讨Hippo信号通路参与HPostC的机制，通过蛋白免疫印迹实验检测了Hippo信号通路中的关键组分MST、YAP的蛋白表达水平以及其磷酸化水平。结果表明，H/R以及HPostC对MST1、YAP的蛋白表达水平没有明显影响，但对MST、YAP的磷酸化水平均有明显影响。如图2所示，与Control组相比，H/R组MST、YAP的磷酸化水平均明显提高，而与H/R组相比，HPostC组MST、YAP的磷酸化水平均明显降低。

图2 MST1和YAP的蛋白表达水平和磷酸化水平（n=3）Fig.2 The expression and phosphorylation of MST1 and YAP

2.3 HPostC影响MST与Bcl⁃xL之间的相互作用采用免疫共沉淀法检测MST与Bcl⁃xL、Bcl⁃xL与Bax间的相互作用。结果显示，H/R组MST与Bcl⁃xL间相互作用明显增强，而HPostC明显减弱了相互作用；H/R组Bcl⁃xL与Bax间相互作用明显减弱，HPostC组却使相互作用得到了部分恢复（图3）。说明HPostC通过影响MST与凋亡相关蛋白Bcl⁃xL间的作用，进而影响Bcl⁃xL与Bax间相互作用，最终抑制心肌细胞凋亡。

3 讨论

IPostC 的心脏保护作用已经明确[3，11-12]，但是其作用机制复杂，影响因素众多，所以确切的机制还在进一步的完善之中。目前，比较公认的作用机制是IPostC可以通过激活再灌注损伤补救激酶（reperfusion injury survival kinase，RISK）信号通路来发挥保护作用[13-14]。本实验采用乳鼠心肌心肌细胞建立缺氧后适应模型，结果显示后适应显著降低细胞凋亡率，增强细胞活性，降低氧化损伤，具有心肌细胞保护作用，这一结果与此前研究及其他研究者的结果一致[10-11]，说明后适应心肌细胞模型建立成功。在后适应模型建立成功的基础上，本研究进一步探讨后适应保护作用的机制。

Hippo信号通路是由一系列蛋白激酶及转录共激活因子所组成的激酶链，可以通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡调控器官发育和大小[4-5]。哺乳动物的Hippo信号通路主要由3部分组成：（1）上游信号分子，NF2、Fat、FRMD等；（2）核心激酶级联反应链，MST、WW45、LATS、YAP等；（3）下游调节因子，TEAD、RASSF等[4]。其中，MST和YAP是这条通路中的核心成分，也是近年来的研究热点。Hippo信号通路从发现至今，在肿瘤的发生发展方面研究较多[15-16]，而在心脏方面的研究较少。近年来，越来越多的研究发现Hippo信号通路在心脏发育、生长、再生甚至心血管疾病形成过程中均发挥了重要作用，其中就包括了缺血再灌注损伤的形成以及心肌梗死[6，8]。MATSUDA等[6]的研究发现在I/R的小鼠心脏中，MST和YAP的磷酸化水平显著升高，这与本研究的实验结果一致。此外，本研究还发现后适应可以降低MST和YAP的磷酸化水平。同时，本研究转染了MST1⁃siRNA使MST1基因沉默，结果显示转染了MST1⁃siRNA的细胞中，后适应处理的保护作用明显弱于转染了阴性对照NC⁃siRNA细胞的，也就是说MST基因沉默后后适应的保护作用被部分取消了，这就说明Hippo信号通路参与了后适应的保护作用。

Hippo信号通路调节细胞增殖凋亡的机制还未完全阐明，根据近年的研究，明确的机制主要有两种：（1）MST与其上游信号分子WW45相互作用，发生磷酸化被激活后，使下游LATS1/2⁃Mob复合物磷酸化并活化，进而使YAP磷酸化，p⁃YAP被阻断在胞浆中，从而限制了YAP进入细胞核促进细胞增殖和对抗细胞凋亡的功能[6，17]；（2）MST通过与Bcl⁃xL 相互作用，使Bcl⁃xL磷酸化，磷酸化位点是新颖的Ser14，p⁃Bcl⁃xL与Bax分离，从而抑制Bcl⁃xL 活性，促进细胞凋亡[7，18]。本研究发现，I/R激活MST，使MST磷酸化水平增加，活化的MST再经过下游信号分子的作用，使YAP磷酸化水平增加，p⁃YAP被滞留在胞浆中，无法进入细胞核刺激相关基因转录，从而抑制细胞增殖促进细胞凋亡。而后适应可以降低MST磷酸化水平，降低MST活性，进而降低YAP磷酸化水平，使更多的YAP进入细胞核，发挥促增殖抗凋亡的作用，这也是后适应保护心肌细胞对抗I/R损伤的机制之一。为了进一步研究Hippo信号通路参与后适应的机制，本研究采用CO⁃IP方法检测了MST与Bcl⁃xL以及Bcl⁃xL与Bax之间的相互作用。本研究发现I/R可以增强MST与Bcl⁃xL之间相互作用，即增加Bcl⁃xL磷酸化水平，促进Bcl⁃xL与Bax解离，从而促进细胞凋亡，这与其他研究者的研究结果是一致的[7，17]。而后适应削弱了I/R促进MST使Bcl⁃xL磷酸化的作用，因而发挥对抗细胞凋亡的保护作用，这说明后适应可以通过削弱MST与Bcl⁃xL之间相互作用来发挥保护作用。

综上所述，Hippo信号通路参与了后适应的心肌保护作用，其机制是：（1）降低MST磷酸化水平，从而降低YAP磷酸化水平，促进YAP进入细胞核内对抗细胞凋亡；（2）削弱MST与Bcl⁃xL之间相互作用，抑制Bcl⁃xL与Bax解离，抑制细胞凋亡。我们将建立在体缺血/再灌注模型，从整体动物水平进一步探讨Hippo信号通路在缺血后适应中的作用及其机制，并深入探索Hippo信号通路中其他成分的作用。