Leptin促进肿瘤相关成纤维细胞活化及卵巢癌腹腔播散

章凡 杨宗元

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科（武汉430030）

卵巢癌恶性程度高，一旦发现大部分患者处于疾病的中晚期并出现典型的广泛腹腔转移及大量恶性腹水[1]。肿瘤微环境在肿瘤发生发展过程中的重要作用越来越被重视。恶性腹水作为卵巢癌患者特异性的肿瘤微环境，其产生与严重程度与疾病预后密切相关[2]；肿瘤微环境中的主要间质细胞成分是肿瘤相关成纤维细胞，其在肿瘤发生、耐药、侵袭与转移过程中起到关键作用[3]。而在腹水微环境中，肿瘤细胞以悬浮形式单个或以球体形式存在，抵抗失巢凋亡压力进而介导腹腔黏附与侵袭过程[4]。腹水中除了大量细胞因子，化学因子之外，还包括大量免疫细胞、成纤维细胞及系膜细胞等。腹腔中的巨噬细胞能够促进卵巢癌球体肿瘤细胞生存及腹腔播散侵袭过程[5]。相比而言，恶性腹水中的成纤维细胞的活性状态及其对卵巢癌细胞黏附侵袭的影响鲜有报道。

瘦素（Leptin）本来作为一个人体能量代谢相关的基因，而如今被报道大量存在于卵巢癌患者恶性腹水中[6]，且其表达水平与卵巢癌患者预后负相关[7]。在以往研究中，Leptin被认为能够诱导卵巢肿瘤细胞发生上皮间质转化，维持肿瘤细胞干细胞属性进而促进肿瘤侵袭[8-9]。在笔者之前的研究中，Leptin被证明通过调控Pi3k/AKT/MTOR通路活化促进卵巢癌细胞侵袭播散，中和腹腔中Leptin能够遏制卵巢癌腹腔播散过程[10]。而Leptin是否通过调控微环境其他类型细胞活化进而间接影响卵巢癌腹腔播散尚无研究。本研究旨在探究Leptin对腹腔微环境中成纤维细胞活性作用，及其对肿瘤细胞恶性行为的影响。同时探索早期靶向腹腔Leptin对腹腔中活化肿瘤相关成纤维细胞含量及活性的改变，以及对卵巢癌腹腔播散结局的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养卵巢癌细胞系SKOV3和OV90购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），成纤维细胞系MRC5购自中科院细胞库，人系膜细胞系HMrSV5购自广州吉妮欧生物科技有限公司，正常卵巢成纤维细胞NOF来源于同济医院肿瘤生物医学中心之前原代培养。肿瘤细胞用McCoy′s 5A培养基（Thermo Scientific），HMrSV5细胞及成纤维细胞用DMEM/F⁃12培养基添加10%胎牛血清，青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL，在37℃，5%CO2条件下传代培养。

1.2 主要试剂与材料McCoy′s 5A及DMEM/F⁃12培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司。重组人Leptin蛋白购于Peprotech公司。IgG及Leptin中和抗体购自R&D公司。α⁃SMA鼠单抗，PDGFRB兔单抗，FAP兔单抗及GAPDH兔单抗购自美国Ab⁃cam公司。DAPI，羊抗兔，羊抗鼠荧光二抗购于武汉三鹰公司。增强化学发光（ECL）底物为美国Pierce公司产品。鼠尾胶原，Matrigel购于BD公司。

1.3 流式分选恶性腹水中肿瘤相关成纤维细胞取高级别浆液性卵巢癌初治患者腹水1 000 mL，在无菌条件下常温离心1 000 r/min×10 min，弃上清后室温下裂解红细胞5 min，PBS洗净后离心1 000 r/min×5 min，0.5%胰酶消化5 min后用200目滤网过滤后再标记兔抗PDGFRB抗体（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用预冷PBS洗2遍后标记FITC标记羊抗兔（1∶100），再用预冷PBS洗2遍后用0.5 mL PBS重悬，用流式分选细胞仪分离FITC+细胞。

1.4 免疫荧光流式分选得到的PDGFRB+肿瘤相关成纤维细胞，或MRC5细胞以及原代NOF细胞（对照组及Leptin处理组），用4%多聚甲醛固定10 min，再用预冷PBS洗2遍，接着用0.1%TritonX⁃100破膜处理10 min，然后用5%BSA室温封闭30 min，同时加鼠抗aSMA抗体（1∶100），37℃孵育2 h。PBS冲洗，同时加Cy3标记羊抗鼠（1∶200），37℃避光孵育1 h。之后均避光操作，PBS冲洗，DAPI工作液染核5 min，PBS冲洗后在荧光显微镜下观察拍照。

1.5 Transwell试验Transwell上室每孔加入60 μL用无血清培养基1∶5稀释的Matrigel，37℃放置2 h备用。凝固后各组小室上室内加入100 μL含2×104SKOV3或OV90细胞的无血清培养基，下室加入500 μL无血清培养基（对照组）或无血清培养基加1×104腹水成纤维细胞（实验组），至培养箱培养48 h。后取出小室，用棉签拭去膜上层细胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，1%结晶紫染色10 min，PBS洗净后风干。高倍镜下计数穿到膜背面细胞数，选5个不同视野计数。

1.6 系膜细胞撕开试验CMAC标记的系膜细胞HMrSV5种于六孔板，用无血清培养基加5%BSA，直到细胞密度达到100%；计数SKOV3或OV90细胞各105个加入系膜细胞培养孔，实验组加入经成纤维细胞共培养48 h后肿瘤细胞，48 h后镜下比较肿瘤细胞球体撕裂系膜细胞面积大小。用Image J软件定量撕裂面积大小。

1.7 ELISA16例恶性腹水来自武汉同济医院妇产科2017年1-4月诊断为卵巢癌的患者，为卵巢癌初治且未接受化疗；同时取此期间12例卵巢良性病变如子宫内膜异位症或卵巢黏液性囊腺瘤患者腹腔冲洗液作为良性对照；良恶性腹水获得后在无菌条件下常温离心3 000 r/min×10 min，取上清存储于-80℃冰箱；ELISA操作步骤按照R&D公司提供的操作指南具体操作。

1.8 公共数据库分析肿瘤微环境中4种主要细胞成分（肿瘤细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及淋巴细胞）Leptin受体LEPR表达值从GEO公共数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中的GSE39396获得，mRNA表达数据通过GCBI数据分析平台（https：//www.gcbi.com.cn）进行标准化，均一化后进行表达水平比较。

1.9 Western blot试验对照组及20 μg/mL Leptin处理72 h的MRC5细胞以及原代NOF细胞，胰酶消化，PBS充分洗涤。RiPA蛋白裂解液提取细胞蛋白，40 μg/孔上样进行SDS-PAGE电泳，低温湿转至PVDF膜，5%BSA封闭40 min，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加HRP标记二抗（1∶3 000），室温孵育30 min，PBS充分洗掉背景后用增强ECL底物曝光。

1.10 胶原回缩试验对照组及20 μg/mL Leptin处理72 h的MRC5细胞以及原代NOF细胞计数6× 105个混入100 μL胶原蛋白悬液（含68.75 μL DMEM/F-12培养基，0.72 μL NaOH（1 mol/L），31.25 μL鼠尾胶原），加入低黏附24孔板中。放置0 h和12 h后在显微镜下分别拍照，胶原面积用Image J软件定量，回缩能力描述为占原始面积的百分数，每个样本均有3个复孔。

1.11 动物试验计数1×106卵巢癌细胞SKOV3接种于NOD⁃SCID免疫缺陷小鼠卵巢包膜，随机分为IgG对照组及Leptin中和抗体处理组（每组12只老鼠）。接种后第1天开始每天1次腹腔给10 mg/kg IgG（对照组）或20 mg/kg Leptin中和抗体（处理组）持续1周；接种后第3天取两组小鼠腹腔冲洗液，分离细胞成分后标记兔抗PDGFRB抗体（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用预冷PBS洗2遍后标记FITC标记羊抗兔（1∶100），流式细胞学检测比较两组PDGFRB+细胞含量差异；接种后第7天取两组小鼠大网膜组织石蜡包埋后，行H&E切片染色显微镜下观察比较微转移灶形成情况；接种后第30天，将各组老鼠麻醉后处死终止实验比较腹腔肿瘤播散情况。所有动物相关操作符合动物试验伦理规范。

1.12 统计学方法每次试验至少重复3次，实验所得计量数据用形式表示，组间差异比较采用非配对student′st检验，应用GraphPad Prism 6.0统计软件。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌恶性腹水中成纤维细胞促进肿瘤细胞恶性行为高级别浆液性卵巢癌患者腹水中肿瘤细胞大多以球体形式存在，流式分选得到了PDG⁃FRB+的肿瘤相关成纤维细胞成典型的长梭形，这些细胞特异性的表达肿瘤相关成纤维细胞标志蛋白aSMA（图1A）。这些腹水来源的肿瘤相关成纤维细胞作为驱化细胞能显著增加卵巢癌细胞SKOV3和OV90的体外侵袭能力（图1B）；同时在系膜撕开试验中，发现腹水来源成纤维细胞不但能显著增加肿瘤球体大小，也能显著增加卵巢癌细胞SKOV3和OV90的系膜撕开能力（图1C）。这些结果表明如同肿瘤原位转移病灶一样，卵巢癌患者恶性腹水中也大量存在肿瘤相关成纤维细胞，这些肿瘤间质细胞能够显著增加卵巢癌细胞的侵袭转移能力。

图1 卵巢癌患者腹水中肿瘤相关成纤维细胞促进卵巢癌细胞侵袭能力Fig.1 Malignant ascites⁃derived CAFs facilitates ovarian cancer cell metastasis

2.2 细胞因子Leptin在恶性腹水中大量表达ELISA检测了12例良性卵巢肿瘤和16例恶性卵巢癌腹水中Leptin的表达水平差异，良性病变中Leptin表达水平为（132.1±15.6）pg/mL，恶性腹水中为（576.4±60.4）pg/mL，两者具有显著的表达差异（P＜0.001，图2A）。因为Leptin主要通过结合其受体LEPR而发挥作用，在结肠癌显微切割芯片表达谱数据中比较了LEPR在微环境中几种主要成分细胞表达差异，发现相比肿瘤上皮细胞和血管内皮细胞，间质成纤维细胞表达更高的LEPR（图2B）。这些结果表明Leptin在卵巢癌恶性腹水中特异性高表达，很有可能作用于间质成纤维细胞并调控起活化进而促进卵巢癌腹腔播散。

2.3 Leptin促进间质成纤维细胞活化成纤维细胞的持续性活化是肿瘤间质促进肿瘤侵袭转移的关键因素。在成纤维细胞细胞系MRC5和原代分离卵巢成纤维细胞NOF中，外源性Leptin细胞因子能够促进陈纤维细胞的骨架伸展，显著增加细胞面积（图3A）；同时，Leptin添加能够显著增加肿瘤相关成纤维细胞标志蛋白如α⁃SMA、FAP及PDGFRB在MRC5和NOF中的表达（图3B）。在胶回缩试验中，与对照组相比，Leptin能显著增加MRC5和NOF细胞回缩重塑细胞外基质的能力（图3C）。这些试验表明Leptin能够调控成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞方向转化，也表明Leptin可能作为一个潜在的之类卵巢癌腹腔播散种植的治疗靶点。

图2 卵巢肿瘤良恶性腹水中Leptin及肿瘤微环境中各种细胞成分Leptin受体的表达情况Fig.2 Leptin expression in benign/malignant ascites and Leptin receptor expression in variant cell types of tumor microenvironment

图3 Leptin促进成纤维细胞活化Fig.3 Leptin promotes malignant transformation of stromal firboblasts

2.4 早期腹腔应用Leptin中和抗体对卵巢癌腹腔播散的影响为观察腹腔中Leptin对间质成纤维细胞的活化及对卵巢癌腹腔种植播散的影响，建立了卵巢癌原位种植模型，SKOV3细胞原位注射后，处理组开始腹腔每天给Leptin中和抗体持续1周，然后在不同时间段监测肿瘤进展情况（图4A）。接种后第3天，在对照组和实验组中取腹腔冲洗液流式检测肿瘤相关成纤维细胞含量。结果表明，Leptin处理组PDGFRB+活化成纤维细胞含量显著低于IgG对照组（图4B）。接种后第7天，在IgG对照组和Leptin封闭抗体实验组中取大网膜和肠系膜组织检测微小转移灶大小。结果表明，Leptin处理组微小转移结节数量和大小显著低于IgG对照组（图4C）。接种后第30天，在IgG对照组和Leptin封闭抗体实验组中白光下观察卵巢肿瘤细胞腹腔播散情况。结果表明，Leptin处理组腹腔转移结节数量和大小显著低于IgG对照组（图4D）。这些结果表明卵巢癌患者恶性腹水中Leptin参与了调控肿瘤相关成纤维细胞活化及肿瘤细胞种植过程，为卵巢癌的腹腔侵袭转移过程提供了良好的微环境。

3 讨论

卵巢癌主要的转移途径是播散种植，即肿瘤细胞从原位剥脱，在腹腔中被不断改造获得生存潜能到达远处定值并形成新的病灶的过程。剥脱的腹水肿瘤细胞在腹腔脱离细胞外基质的状态下，通过聚集抱团形成多细胞球体放大生存信号。同时，肿瘤发生发展过程中肿瘤微环境被活化，大量细胞因子和活化间质细胞协调肿瘤侵袭过程。在肿瘤原位转移实体病灶中，成纤维细胞被肿瘤细胞释放的TGFβ1活化为肿瘤相关成纤维细胞，后者继而释放大量细胞因子促进肿瘤细胞恶性进程[11]。腹水作为卵巢癌侵袭播散的重要阶段，其中成纤维细胞的活化状态，以及其对腹水肿瘤细胞的调控对肿瘤细胞侵袭至关重要。本文旨在研究腹水中肿瘤相关成纤维细胞的活性调节及其对卵巢癌腹腔播散种植的影响。

的确，如同在肿瘤原位转移病灶中一样，腹水中大量存在活化的肿瘤相关成纤维细胞。这些腹水来源的肿瘤相关成纤维细胞能够促进卵巢癌细胞侵袭及系膜撕开能力，从而加速腹腔侵袭过程。腹水中这些肿瘤相关成纤维细胞可能来自原位剥脱而来，或恶性转化的系膜细胞，血管内皮细胞以及骨髓来源的间充质干细胞[12]。这表明腹水微环境中，除了细胞因子成分，间质成纤维细胞也促进了卵巢癌的腹腔播散过程。

实验结果表明Leptin在恶性腹水中特意性高表达，且Leptin受体在成纤维细胞表面高表达，提示Leptin很可能影响调控成纤维细胞的活化过程。的确，Leptin能够促进成纤维细胞细胞系MRC5及正常卵巢成纤维细胞NOF表达肿瘤相关成纤维细胞特异标志蛋白，促进其回缩基质能力。鉴于肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤进展中的关键作用和Leptin的潜在调控间质细胞活化作用，笔者在卵巢癌原位种植模型中观察到早期腹腔中和Leptin能够显著抑制腹腔活化成纤维细胞数量及腹腔播散种植结局。以往关于Leptin在卵巢癌发生发展过程中的作用大多从肥胖女性卵巢癌发生易感性的角度探讨其对卵巢癌发生发展过程中作用，或从Leptin作为细胞因子活化肿瘤生存通路恶性转化卵巢肿瘤细胞角度探讨其对卵巢癌进展的影响[13-14]；本研究关于Leptin调控成纤维细胞活性的发现弥补了之前Leptin调控肿瘤细胞上皮间质转化的作用，表明其具备调控上皮及间质细胞活化的双重作用。在今后的研究中，还需要进一步对Leptin调控成纤维细胞活化进行机制研究及其对微环境中其他成分如肿瘤相关巨噬细胞活化的调控作用。

总之，本研究在卵巢癌恶性腹水中发现大量肿瘤相关成纤维细胞，促进了肿瘤细胞的侵袭和系膜撕开能力；同时腹水中Leptin参与维持成纤维细胞的持续性活化，早期干预Leptin有望成为遏制卵巢癌腹腔播散的靶点。然而还需要进一步探究靶向Leptin对机体正常细胞组织的影响，确定其作为靶向治疗的可行性和安全性，希望靶向腹水成纤维细胞活化或Leptin成为改善卵巢癌腹腔播散结局的有效手段。