HOXD10在肝外胆管癌中的表达及其临床意义

周九鹏 王英霞

1西安市胸科医院（西安 710000）；2昆明医科大学第一附属医院（昆明 650000）

胆管细胞癌（CCC）占胃肠道肿瘤的3%，在原发性肝癌中位列第二[1]，目前5年生存率仍不到5%[2]。因此，有必要寻找一种肿瘤标志物用于诊断CCC的预后，寻找可能的靶向治疗。

同源异形盒D10（HOXD10）是HOX基因家族主要的调节基因的成员，直接调节器官形成和维持分化组织的功能。已证实多种肿瘤组织或细胞HOXD10表达水平明显低于正常组织，如乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、胶质瘤[6]、肝细胞癌（HCC）[7]。恶性乳腺癌细胞HOXD10表达的恢复可明显抑制细胞的迁移和增殖[3]。HOXD10表达丢失可增强乳腺癌的侵袭的能力[8]。然而HOXD10在CCC的表达及作用却少有报道，本文旨在研究HOXD10在肝外胆管癌（ECC）组织中的表达及其预后意义。

1 对象与方法

1.1 患者及组织样本该研究由西安市胸科医院、昆明医学院第一附属医院医学研究伦理委员会批准。本研究回顾了1998年11月至2013年11月在上述医院接受手术治疗的174例患者的数据资料。入选标准为：组织学证实的ECC的患者，确诊时无远处转移，除皮肤癌外无恶性肿瘤史，排除术前和术后化疗史及肝内胆管癌和壶腹癌患者。

1.2 病理学评估所有病理切片均由两位病理学专家评估，主要判断肿瘤生长方式、组织学分化、病理切缘状态、淋巴管浸润情况、周围神经侵袭情况和淋巴结肿瘤状态。所有患者根据第七版（AJCC）ECC的分期系统进行分期。

1.3 随访术后所有患者均接受常规临床随访，包括术后每1～3个月进行CT扫描、肝功能检查和糖类抗原 19⁃9（CA19⁃9）检查。评估术后生存情况：随访至患者死亡或研究截止日期2015年12月10日。到研究结束时，119例（68.3%）患者死亡。

1.4 免疫组织化学染色与评估组织切片（4 μm）石蜡包埋，福尔马林固定后进行免疫组织化学染色：HOXD10鼠抗人单克隆抗体（1∶800；abgent公司）。免疫组化染色采用SABC法（Vectastain Elite ABC 试剂盒，Vector Laboratories，Burlingame，CA）。抗原修复：微波炉95℃ 15 min，冷却95℃2 h，脱蜡切片用含3%过氧化氢的甲醇处理10 min。PBS清洗10 min后血清封闭。抗HOXD10单克隆抗体4℃孵育过夜。PBS清洗后，生物素标记的羊抗鼠二抗孵育10 min，之后过氧化物酶标记链霉亲和素孵育10 min，DAPI显色。苏木精复染细胞核。常规应用免疫组化阳性和阴性对照。每个切片进行免疫反应评分基于免疫阳性细胞的比例（0：＜10%；1：≥ 10%～ ＜25%；2：≥ 25%～＜50%；3：≥50%～ ＜75%，4：≥75%）乘以染色强度（0：无着色；1：轻度；2：中度；3：强着色）。HOXD10表达水平分为4级：0：阴性；1～ 4：弱阳性；5～ 8：中度阳性；9～12：强阳性。

1.5 统计学方法分类变量采用Pearson卡方检验，等级变量采用非参数检验进行比较。用Kaplan⁃Meier单因素分析法分析可能的预后因素，用Cox比例风险模型进行多因素分析。统计分析应用SPSS18.0软件。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXD10在ECC表达的免疫组化结果ECC组织HOXD10表达水平比正常癌旁组织明显降低（P=0.001，图1A）。HOXD10表达降低伴随着肿瘤分化程度的降低（图1B）。ECC组织的细胞核和细胞质中均有HOXD10表达，与以前的研究相一致（图1C、D、E）[9-10]。

图1 HOXD10 CCC组织中与癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of HOXD10 in CCC tissues and normal para⁃carcinoma tissues

2.2 HOXD10表达与ECC临床病理特征相关性HOXD10高表达与ECC的低组织学分级（P＜0.001）和低的 T分期（P=0.002）明显相关。HOXD10蛋白表达与其他临床病理特征无显著相关。见表1。

2.3 HOXD10表达对ECC的预后价值单因素生存分析示，与HOXD10表达阳性的患者相比，HOXD10阴性和阳性患者平均总生存期分别为14个月和23.7个月（P＜0.001，表2）。淋巴结转移（P＜0.001）、组织学分级（P=0.018）、晚的临床分期（P＜0.001）及手术切缘（P＜0.001）可显著影响ECC患者的预后。Cox比例风险模型分析表明HOXD10蛋白表达阴性是总生存期的不良独立预后因素（P=0.002，HR=1.830，表3）。

3 讨论

本研究显示，相比正常癌旁组织，HOXD10蛋白水平在ECC组织表达下调。这与之前乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、肝癌[7]、结肠癌[11]、甲状腺癌[12]和前列腺癌[13]中的研究一致。在这些肿瘤中，HOXD10已被证实抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[3-7]。相反的是，口腔鳞状细胞癌HOXD10表达明显高于正常口腔黏膜[14-15]。过度的HOXD10表达在头颈部鳞癌细胞株表现为促进增殖、黏附和迁移[9]。HOXD10在人类肿瘤生长中也许有不同的作用。

图2 单因素分析显示，与HOXD10阴性表达的患者相比，HOXD10阳性表达的ECC患者有较长的总生存期（P＜0.001）Fig.2 The analysis with Kaplan⁃Meier method clearly showed that ECC patients having tumors with HOXD10 positive expression had increased overall survial compared with patients with negative HOXD10 expression（P ＜ 0.001）

表1 HOXD10表达与174例ECC临床病理特征相关性Tab.1 Association of HOXD10 expression with the clinicopathological features of 174 patients with ECC 例

表2 ECC患者预后与各种临床病理参数的单因素分析（n=174）Tab.2 Univariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

表3 ECC患者预后与各种临床病理参数的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

进一步的分析显示，HOXD10蛋白表达与组织学分级、T分期有关。HOXD10表达水平随着肿瘤分化程度的降低而降低（图1B）。已有研究显示HOXD10表达水平随着乳腺肿瘤[16-17]、胃癌[18]和子宫内膜癌[19]的组织学分化降低而降低，与本研究结果一致。WANG等[20]却认为HOXD10表达与胃癌分化无关，与胃癌的T分期显著相关。本研究并未发现HOXD10与淋巴结转移及AJCC分期相关。而有研究报道，转移性胃癌组织较无转移性者HOXD10显著下调[18]。原因可能是本研究纳入了更多的没有远处转移的样本。这表明局部淋巴结转移与远处转移之间可能存在着不同的分子机制，有待进一步探讨。

单因素分析显示，HOXD10蛋白表达阳性的患者相比阴性预后较好（P＜0.001，图2）。这与之前胃癌[5]结果相似。而HOXD10表达水平并没有影响OSCC肿瘤的生存率[15]。HOXD10对于不同的肿瘤可能具有不同的功能。Cox比例风险回归分析发现HOXD10阳性表达对ECC总生存期是一个独立的预测因素，与YANG等[10]的研究一致。HOXD10表达也是胃癌[20]、前列腺癌[13]患者预后的独立预测因素。这均表明HOXD10可作为ECC患者的独立预后标志物。

在乳腺癌中，miR⁃10b[21]、miR⁃36b[22]下调HOXD10通过Akt信号通路促进细胞的侵袭。LIN等[23]发现胃癌中HOXD10启动子甲基化率明显增高。在HCC中，HOXD10的表达也受启动子区甲基化的调控，通过抑制ERK信号传导，抑制肝癌细胞的生长。miR⁃10b通过靶向HOXD10刺激RHOC的上调，促进结直肠癌的侵袭和迁移。另外，在甲状腺癌中[12]，BRAF突变状态与HOXD10甲基化和表达水平有关。HOXD10的作用机制已在其他肿瘤描述。HOXD10在ECC中抑制肿瘤的机制的尚不明确，今后需进一步的研究来阐明HOXD10对ECC的详细作用机制。

总之，HOXD10蛋白在ECC中的表达比正常癌旁组织明显下降，HOXD10蛋白的高表达与良性的临床病理特征和较高的总生存期相关。因此，HOXD10可作为预测ECC恶性行为的一个指标。