三叶白术汤口服液的遗传毒性试验

邓利斌，景俊年，赵胜军，肖希龙

(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉430023)

紫苏叶、藿香、淡竹叶、白术均为容易栽培、资源丰富、价格低廉的天然植物药物。此四味草药组成方剂三叶白术汤具有芳香解表，健脾化湿的功效。此研究对三叶白术汤的遗传毒性进行研究，为其作为新兽药的临床安全性评价提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 受试物 三叶白术汤口服液由武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室自制，批号为160315，为综红色澄明液体，由紫苏、藿香、淡竹叶、白术等成分组成水煎浓缩而成，每毫升含生药量1 g。猪的临床推荐量为0.1 mL/kg·bw，每日口服1次。

1.2 试验系统 三项遗传毒理试验所用菌株、细胞和实验动物均符合《药物遗传毒性研究技术指导原则》[1]推荐的试验系统。Ames试验所用试验菌株为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，染色体畸变试验所用试验细胞为中国仓鼠肺成纤维细胞株(CHL)，两个试验所需的S9肝微粒体酶，均购自美国MOLTOX公司；经生物特性鉴定合格后用于试验。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验使用SPF级昆明系雄性小鼠30只，7～8周龄[1-2]，体重28～30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为：SCXK(京)2011-0012。

1.3 试验仪器和试剂 试验仪器：BX51光学显微镜(Olympus)，XSP-17CZ倒置显微镜(上海长方光学仪器有限公司)；L535R台式超低温高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；AC2-4S1生物安全柜(ESCO新加坡艺思洁净设备有限公司)；2306-2二氧化碳恒温培养箱(美国SHELLAB)；DH6000II电热恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)等。

试验试剂：琼脂粉(SIGMA)，氧化型辅酶Ⅱ(Roche)，葡萄糖-6-磷酸(Sigma公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE (Hyclone公司)；Giemsa染液(Solorbio公司)；环磷酰胺(SIGMA-ALDRICH公司)；秋水仙碱(Sigma公司)；丝裂霉素C(Biotopped公司)；敌克松，2-氨基蒽(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；叠氮钠(Sigma公司)；2-氨基芴(Sigma公司)/1,8-二羟基蒽醌(Merck公司)等。

1.4 试验方法

1.4.1 Ames试验[1～4]将受试物在无菌条件下加无菌蒸馏水先20倍稀释后再5倍倍比稀释4次，获得浓度为50 000、10 000、2 000、400、80 μg/mL共5个浓度，同时设阴性对照组(无菌蒸馏水)及阳性对照组敌克松500 μg/mL，叠氮钠15 μg/mL，二氨基蒽200 μg/mL，1，8-二羟基蒽醌100 μg/mL，2-氨基蒽200 μg/mL。所有的受试物组均需在加入和不加入S9的条件下进行。阳性组设计为：在+S9条件下TA97a，TA98和TA100的阳性对照品为2-氨基芴，TA102的阳性对照品为1,8-二羟基蒽醌，TA1535的阳性对照品为2-氨基蒽；在-S9条件下TA97a，TA98和TA102的阳性对照品为敌克松，TA100和TA1535的阳性对照品为叠氮钠。试验采用平板掺入法，每皿加入0.1 mL受试物/对照品，0.1 mL菌液和0.5 mL S9混合液(+S9)。将所有平皿培养48 h进行菌落计数。根据指导原则要求，Ames试验至少重复一次进行验证。

1.4.2 中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验[1,5-6]将受试物在无菌条件下用无菌蒸馏水稀释至浓度为50、16.67、5.56 mg/mL共3个浓度。同时设阴性对照为无菌蒸馏水，设阳性对照为环磷酰胺(80 μg/mL，+S9))和丝裂霉素C(4 μg/mL，-S9)。试验需在±S9的条件下进行。试验步骤和方法参考《药物遗传毒性研究技术指导原则》和“GB 15193.23-2014”等指导原则进行，将CHL细胞用药物进行6 h，24 h，48 h处理，然后制成玻片标本。并显微镜下阅片。根据阅片记录计算畸变率：畸变率(%)=(染色体发生结构畸变的细胞数/观察细胞总数)×100%。

1.4.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验[1-2,7]30只雄性小鼠分为5组，每组6只，采用灌胃给药。分别设2 000、1 000、500 mg/kg剂量组，阴性对照组给予稀释药物用的蒸馏水，阳性组给予环磷酰胺40 mg/kg。阳性组给药1次后22～24 h，其他组给药2次后22～24 h，采用颈椎脱臼法处死动物，取骨髓涂片、固定、Giemsa染色并于显微镜下阅片。每只动物计数2 000个嗜多染红细胞中出现微核的细胞数，计算微核率，以千分率表示。另外，计数每只动物200个红细胞中嗜多染红细胞与总红细胞(嗜多染红细胞和正染红细胞)的比值。

1.5 统计学分析与结果判定标准

1.5.1 Ames试验 根据每个平皿的回复突变菌落数，统计平均回复突变菌落数和标准差。受试物组的菌株回变菌落数应等于或大于未处理阴性对照组的2倍以上，且具有剂量-反应关系或某一测试点具有可重复增加则判定阳性结果[4,6]，否则为阴性。

1.5.2 中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验 经方差分析(χ2检验)，受试物所诱发的染色体畸变率与阴性对照组相比，出现浓度依赖性的增加，或出现可重复性的增加，并且与阴性对照组相比，差异显著(P≤0.05)，可判定为阳性结果，否则为阴性。

1.5.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 经方差分析。当受试物组微核率出现剂量依赖性升高，并且与对照组微核率比较有显著差异时(P<0.05)，判定为阳性反应，否则为阴性。

2 试验结果

2.1 Ames试验 Ames试验结果见表1和表2。两次Ames试验三叶白术汤口服液各剂量组菌落数均未超过阴性对照组的2倍。说明三叶白术汤口服液没有诱发TA97a，TA98，TA100，TA102和TA1535五种菌株产生回复突变的作用，试验结果为阴性。

2.2 中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验 CHL染色体畸变试验结果见表3。试验结果显示，在此研究试验条件下，三叶白术汤口服液5、1.67 mg/mL和0.56 mg/mL三浓度均没有致CHL细胞染色体畸变率升高，试验结果阴性。

2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 微核试验结果见表4。

三叶白术汤口服液低、中、高剂量组小鼠微核发生率均低于4‰，均不超过微核自然发生率[7]，组间相互比较无显著性差异(P>0.05)，证明三叶白术汤口服液低、中、高剂量组小鼠微核发生率未出现剂量依赖性升高；三叶白术汤口服液低、中、高剂量组与阴性对照组比较，也无显著性差异(P>0.05)，可以判定试验结果阴性。“嗜多染红细胞数/总红细胞数”作为毒性指标，各受试物组与阴性对照组比较，差异均不显著(P>0.05)，表明在此研究试验条件下，三叶白术汤口服液低、中、高剂量均没有明显骨髓红细胞毒性。

组别剂量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三叶白术汤口服液898.00±12.17138.33±32.1547.00±17.0948.00±11.36177.00±12.12133.00±4.36251.00±51.10359.33±16.078.33±4.049.67±0.5840109.67±9.02148.67±11.5941.00±2.6550.67±3.06172.67±16.04145.33±12.50279.67±7.64379.67±16.296.67±3.066.67±1.5320089.00±8.19161.00±10.4451.33±12.2245.67±4.62186.33±8.33136.00±32.08300.33±45.00388.67±12.507.33±3.219.33±2.31100098.67±1.53172.67±14.1542.33±6.4347.33±3.06123.33±9.02147.67±15.18279.67±38.18370.00±14.935.67±2.527.67±3.06500078.33±10.50175.67±8.9640.00±24.5249.33±2.89114.00±23.81140.00±8.66259.33±46.69370.67±26.272.00±2.653.00±1.00阴性对照组89.00±10.54151.33±27.0643.67±3.2146.33±5.13146.33±9.07164.33±6.11253.33±8.14403.00±9.857.33±3.2111.33±7.57阳性对照组1092.00±156.18971.00±123.841030.33±157.071116.00±142.03889.33±104.64964.33±137.501235.33±103.50866.33±5.51236.00±3.46232.33±19.40

组别剂量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三叶白术汤口服液898.67±11.55108.33±7.6438.00±16.7034.67±3.21109.67±3.51145.67±4.04228.00±18.52289.00±61.4916.67±15.3110.33±6.6640105.00±14.42112.00±12.1243.33±1.5344.33±8.96140.00±4.36127.00±42.58271.00±8.72253.00±8.896.67±3.798.67±5.51200122.00±20.78143.33±35.8142.67±1.1539.33±2.08136.33±11.72102.33±5.86277.67±45.72286.33±30.9212.00±3.4622.33±14.571000124.67±8.14127.67±25.8136.33±5.5136.00±3.46116.67±16.77132.67±13.05260.33±25.54307.00±6.0810.33±4.0413.33±4.1615000106.00±8.72113.67±31.5042.67±6.8133.67±6.03143.00±11.00155.00±59.91309.33±11.06297.67±13.3216.00±18.5211.67±5.86阴性对照组100.67±5.0396.33±5.5147.00±1.7335.00±14.11144.00±11.27183.33±25.17311.00±10.00316.33±62.1716.33±17.2116.33±3.21阳性对照组932.67±231.73959.33±139.43974.67±125.87914.00±60.511329.00±13.00889.67±100.502545.67±288.27915.67±62.58360.67±86.64226.33±12.34

表3 三叶白术汤口服液致CHL染色体畸变试验结果

注：一个细胞中出现2个或2个以上畸变类型，畸变细胞数计为1个；为了便于统计分析将空白对照组的剂量计为0 μg/mL。

*：与空白对照组相比，差异极显著(P<0.01)

组别微核率(‰)嗜多染红细胞数/总红细胞数阴性对照组1.58±1.320.60±0.10阳性对照组16.25±5.16**0.59±0.11药物低剂量组1.50±1.050.59±0.09药物中剂量组1.83±0.520.51±0.05药物高剂量组1.58±1.280.56±0.07

**：与阴性对照组比较，P<0.01

3 讨论

三叶白术汤口服液组方中的紫苏、藿香、淡竹叶及白术四种植物“药食两用”已久，可见安全性。但三叶白术汤口服液需经过毒性试验对其安全性进行验证。Ames试验作为细菌回复突变试验已被证明能检出相关的遗传学改变(移码突变和碱基置换)和大部分啮齿类动物遗传毒性致癌剂[1]。因细菌作为原核生物不能完全检测DNA损伤，所以又进行了哺乳动物细胞-中国仓鼠肺成纤维细胞株(CHL)染色体结构和数目畸变的体外试验。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验作为遗传损伤体内试验可提供一个包括影响受试物遗传毒性作用的其他相关因素(吸收、分布、代谢、排泄)的试验模型，可以另外检出某些遗传毒性物质。此研究的三项遗传毒性试验是药物遗传毒性研究技术指导原则推荐的标准组合：包括体内和体外试验，从原核到真核细胞，可以全面的检测三叶白术汤口服液是否具有潜在的遗传毒性。此研究的三项遗传毒性试验均为阴性，表明在此研究试验条件下，三叶白术汤口服液无遗传毒性。