八味中药及其复方对鸡大肠杆菌的体外抑制试验

鹿 意，梁 晓，秦志华，张启迪

(青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)

大肠杆菌属于革兰阴性菌，是寄生在肠道内的正常菌群。在一定条件下，一些血清型的大肠杆菌能引起一系列的感染，给养禽业造成严重损失[1-2]。鸡大肠杆菌病在国内中小规模养殖场普遍存在，发病率较高，已成为高危害疾病之一[3]。兽医临床上主要应用喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等药物预防和治疗大肠杆菌病[4]。在防治过程中，抗生素的大量使用，使新的耐药菌株不断出现，导致耐药谱不断扩大，甚至研制出的新型抗生素对于一些菌株也表现出极强的耐药性，导致在养殖业中形成了恶性循环[5]。国内外对大肠杆菌的耐药性均有过报道，不仅威胁家畜，就连野生动物也幸免不了，因此，世界各国均十分重视大肠杆菌的耐药性问题[6]。

中药与化药相比，纯天然且易于获取，毒副作用较小，耐药性相对较低，能增强动物机体的抵抗力，从而获得越来越多的研究者们的青睐。因此，本试验选用金银花、黄连、五味子、连翘、大黄、黄芩、黄柏、白头翁等中药，通过一系列试验来进一步研究其对抗大肠杆菌的效果，为临床研发新的高效、低毒的中药复方制剂来有效的防治大肠杆菌病提供参考[1]。对克服抗生素带来的大肠杆菌的耐药性、提高我国畜产品在国际上的竞争力具有十分重要的意义[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 金银花、黄连、五味子、连翘、大黄、黄芩、黄柏、白头翁，所有药材，均购自国风大药房城阳药店。

1.1.2 培养基 普通营养肉汤、普通营养琼脂，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司。

1.1.3 菌株 鸡大肠杆菌菌株来自本研究室从患病畜禽病料中分离、鉴定和保存的优势菌株。

1.2 方法

1.2.1 中药的制备 中药各称取50 g放入烧杯中加600 mL蒸馏水，武火加热至沸腾然后文火加热，时间持续1 h并用玻璃棒不断搅拌，加热完成后用8层纱布过滤；取药渣，再倒入500 mL蒸馏水，步骤同上。过滤合并滤液，并加热浓缩至1 g/mL，室温放置24 h，10 000 r/min离心5 min，取上清液，高压灭菌，置4 ℃中保存。1.2.2 培养基的制备 普通LB肉汤、普通营养琼脂培养基均按常规方法配制，4 ℃保存待用。

1.2.2 单味中药的抑菌试验 打孔法：取100 μL供试菌均匀的涂布于营养琼脂上，放置15 min后在营养琼脂上用直径6 mm的打孔器均匀打孔，除去琼脂块，加入的药液以满而不溢为原则，37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径，设置LB肉汤为阴性对照。

药敏试验判定标准：当抑菌圈直径大于15 mm时为高敏；介于10～15 mm间时为中敏；小于 10 mm 时为低敏[8]。

1.2.3 中药复方的筛选及抑菌试验 制备中药复方水提液：把黄连、黄芩、五味子、金银花提取液按1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶1、1∶1∶3∶1、2∶1∶2∶1、1∶2∶2∶1、1∶1∶2∶1、3∶1∶3∶1、3∶1∶1∶1的不同比例配伍，依次命名为复方Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，此试验制得的药物的浓度为1 g/mL，10 000 r/min离心5 min后过滤，高压灭菌后4 ℃保存。复方中药的抑菌试验与1.2.3同。

1.2.4 MIC和MBC的测定 选用二倍稀释法，具体步骤见表1。取0.1 mL稀释好的菌液(2×109CFU/mL )加入上述1～7号及9号试管中，恒温培养24 h。取MIC的平均值作为试验数据来判定复方中药的体外抑菌效果。无细菌生长的最低药物浓度管即为最小抑菌浓度(MIC)[9]。测最小杀菌浓度(MBC)值时，选取没有细菌生长的培养物，接种营养琼脂培养基，恒温培养(37 ℃)18 h。培养基内生长的菌落数≤ 5的最小药物浓度，即为药物的MBC[10]。

2 结果

2.1 单味中药抑菌结果 八味中药对大肠杆菌均表现出不同程度的抑菌效果，其中五味子的抑菌效果最佳，抑菌直径为25.1 mm±2.06 mm，属高度敏感；黄连、金银花、连翘为中敏；抑菌直径分别为12.9 mm±0.59 mm、11.3 mm±0.35 mm、10 mm±0.74 mm，其余均为低度敏感，具体数据见表2。

表2 单味中药抑菌结果

2.2 复方中药抑菌结果 所有的复方制剂在体外均表现出了一定的抑菌效果，复方Ⅵ效果最明显，其抑菌直径为28.5 mm±1.02 mm，具体数据见表3。

表3 复方中药抑菌结果

2.3 中药MIC、MBC测定结果 各单味中药和复方中药的MIC和MBC值见表4，其中五味子的MIC值为7.812 mg/mL，MBC值为7.812 mg/mL，抑菌效果较强，明显高于其他中药，其次是黄连和连翘，也表现出了较好的抑菌效果。复方Ⅵ的抑菌效果强于其他复方，MIC为15.625 mg/mL，MBC为31.25 mg/mL。

表4 中药MIC、MBC测定结果 (mg/mL)

3 讨论

本试验中所得的中药抑菌直径与相关文献[11-13]有一定差异，原因可能有以下几个方面：一是所用大肠杆菌来源不同，如向双云等所用大肠杆菌K88来源于中国兽医药品监察所，赵恒章等所用大肠杆菌是直接从病(死)猪分离，王铁良所用大肠杆菌是从临近鸡场病料中分离得到； 二是中药的提取方法不同致使抑菌结果有所差异；三是所用的菌液的浓度也会对试验结果产生一定的影响，上述因素均可能导致抑菌直径偏大或偏小，为减少试验中不确定因素对试验结果造成的影响，应对中药的提取方法进行完善，并设置平行试验。

本试验通过肉汤稀释法对中药的MIC值进行测定，由于中药成分复杂，可能是组方中单味中药发挥了抑菌作用，也可能是多为中药共同发挥作用。试验结果表明，复方制剂Ⅵ对大肠杆菌体外抑菌作用最好，MIC为15.625 mg/mL；复方制剂Ⅰ和Ⅷ 对大肠杆菌的体外抑菌作用最低，MIC 均为62.5 mg/mL。本试验通过配制八组中药复方制剂水提物，根据药敏试验、MIC及MBC测定结果得出，中药复方制剂的抑菌作用均优于单味中药，可为临床上研发抗大肠杆菌病的中药复方制剂提供参考。