羊结肠小袋纤毛虫病的诊断与防治

周 叶，宋开放，崔琳琳，翟焕杰，邵立圣，杨树宇，姜金庆，刘俊伟

(河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003)

羊结肠小袋纤毛虫病是由纤毛虫纲、毛口目、小袋虫科、小袋虫属的结肠小袋纤毛虫寄生于羊的大肠内所引起的以腹泻、脱水、消瘦和贫血为特征的人兽共患原虫病。引起羊腹泻的疾病，临床常见的有球虫病、鞭虫病、羔羊痢疾、大肠杆菌病、沙门菌病、食道口线虫病、夏伯特线虫病、食盐中毒、隐孢子虫病、副结核病等[1-2]，但关于羊结肠小袋纤毛虫病引起的腹泻尚未见报道。笔者在兽医临床诊疗过程中，通过对疑似羊结肠小袋纤毛虫病的病羊进行临床检查，粪便实验室检验，粪便水洗沉淀物染色镜检，药物敏感性试验，诊断为羊结肠小袋纤毛虫病，并用甲硝唑、中药驱虫净散等进行了防治试验，有效控制了该病，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 试验羊来自新乡市某杜泊绵羊养殖户，饲养规模100只，放牧散养，其中30只患严重腹泻疾病。

1.2 试剂与药品 可溶性淀粉培养基、蒸馏水、生理盐水、二甲苯、0.4%氢氧化钠溶液、2%碘液、美蓝染色液、甲醇、2.5%戊二醛、福尔马林、甲硝唑片等，由河南科技学院临床兽医学教研室提供；中药驱虫净散的原材料，购自新乡市医药公司，并按文献3的方法进行制备。

1.3 临床检查 采用问诊、视诊等临床基本检查方法对发病羊群进行检查，调查羊场的病史和临床发病症状。

1.4 粪便采集 采集粪便时，术者依次戴上医用乳胶手套和PVC手套，直接用手指从直肠内掏取粪便，再将PVC手套翻转脱下，羊粪即被包含其中，也可将采集到的羊粪放入洁净塑料袋中，编号登记后备用。如不能及时送检，可称取粪便10 g，加入90 mL 2.5%戊二醛或5%～10%福尔马林中固定后送检。

1.5 粪便直接压片法检查 取一片洁净的载玻片，在玻片中央滴加1～2滴生理盐水(冬季需加温)，然后用镊子挑取少量粪便，与蒸馏水混匀，并将粗粪渣推向一边，涂布均匀，作成涂片，涂片的厚薄以放到书上隐约可见下面的字迹为宜，加上盖玻片，置显微镜下检查。粪便采集后应注意保温，并及时送检，冬季可放置28 ℃培养后再进行观察，防止羊结肠小袋纤毛虫滋养体运动性丧失或胞膜破裂。

1.6 粪便水洗沉淀物染色镜检 取4个1.5 mL离心管，加入羊结肠粪便混悬液各1 mL，1 500 r/min离心2 min，弃去上清液，分别加入美蓝染色液，2%碘液，苏木素染色液，瑞氏染色液各1 mL，震荡混匀，置室温染色，定期观察染色效果，染色完毕，1 500 r/min离心2 min，弃去染色液，用蒸馏水离心洗涤3次，终止染色，必要时用1%盐酸乙醇或蒸馏水分化，再用60%、70%、80%、90%、100%乙醇(2%碘液组脱水后，还需经2%碘无水乙醇复染)，逐级脱水，每级脱水15 min，之后离心弃去上清液，沉淀加入二甲苯1 mL，震荡混匀，透明30 min，离心后，用加样器吸取0.7 mL二甲苯，震荡混匀，吸取悬液10 μL，均匀涂于载玻片中部，待二甲苯将干未干之际滴1滴中性胶，用眼科镊子夹一洗净擦干的盖玻片，使盖玻片一端衔接处中性胶后轻轻放下，中性胶即平铺于盖玻片之下，之后玻片于60 ℃干燥箱中烘干，置显微镜下观察。

1.7 药物敏感性试验 首先用可溶性淀粉培养结肠纤毛虫：复方氯化钠注射液500 mL，无菌操作加入标准胎牛血清25 mL，震荡混匀，置用4 ℃冰箱备用，用时每8 mL加入灭菌可溶性淀粉一铂耳，进行前述粪便中结肠小袋纤毛虫人工培养[4]。

然后，在96孔细胞培养板加入可溶性淀粉培养基50 μL/孔，至第12孔；每孔分别加入羊结肠小袋纤毛虫悬液50 μL，轻轻震荡细胞培养板，使各孔混匀，置28 ℃培养12 h，置倒置显微镜下观察羊结肠小袋纤毛虫滋养体的存活情况。将丙硫苯咪唑，盐酸左旋咪唑，甲硝唑，痢特灵，乳酶生，土霉素片，复方新诺明，血虫净、氨苄青霉素钠和中药驱虫净散制备成100 mg/mL混悬液或溶液，在前述细胞培养板中分别加入倍比稀释的药品溶液100 μL，观察小袋纤毛虫滋养体的存活情况。

1.8 药物防治试验 将羊场患严重腹泻的30只羊，根据发病情况平均划分为甲、乙两组，每组15只。甲组病羊用甲硝唑10 mg/kg体重，经口灌服，2次/d，连用3 d。乙组病羊用中药驱虫净散治疗，体重在50 kg以上的羊投50 g/次，体重在50 kg以下的羊25 g/次，开水冲，候温一次灌服，1次/d，连用7 d。同时，重症病羊配合补液，补糖，补充钙、磷和氨基酸，配合抗菌、止泻、解毒、强心、健胃等对症治疗措施。

2 结果与分析

2.1 临床检查结果 笔者走访发现，该绵羊养殖户采用圈养结合放牧的饲养方式，放牧时采食路边、河边的杂草和落叶，补饲花生秧、玉米、豆腐渣等饲料，圈舍是靠墙搭建的水泥瓦棚，粪尿清理不及时，有刺鼻氨气味，户主曾使用伊维菌素驱虫。本次共30只羊发病，发病率为30%，典型症状与其他动物结肠小袋纤毛虫病一致[5-7]。严重者多见于3～4月龄羔羊，可见病羊精神沉郁，体温39.5 ℃～40.5 ℃，食欲减退或废绝，饮欲增加，眼球下陷，皮肤弹性下降，起初排出软粪，很快变为糊状稀粪，甚至呈水样，带有黏液，气味腥臭，后躯及尾部被稀粪污染。慢性病例多见于产后母羊，病羊精神不振，四肢无力，喜欢卧地，食欲减退，异嗜，食欲废绝，体温正常或低下，病羊日渐消瘦，皮下脂肪减少，绵羊尾脂急剧减少，被毛粗乱，黏膜淡白或苍白，粪便含水量增加，排团状或条状软粪，呈粒状、团状或泥状。

2.2 粪便直接压片法镜检结果 病羊新鲜粪便直接压片镜检时，由于滋养体不断运动，观察和拍摄相对困难，可在虫体运动缓慢时用快门进行连续拍摄，结果见图1。羊结肠小袋纤毛虫滋养体呈梨形、纺锤形、卵圆形或圆形，灰黄或灰黑色，前端稍尖，中部最宽，后端稍圆。滋养体全身密生纤毛，纤毛摆动时呈规律的波浪状，使滋养体迅速前进，旋转。伸缩泡无色透明，有前、后两个，后方的一般较大，病羊粪便越稀，滋养体数目越多，运动越活泼，后伸缩泡也越大，甚至可达滋养体的二分之一[8]。

图1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体，粪便直接压片 (400×)

2.3 粪便水洗沉淀物染色结果 粪便沉淀物水洗后，可见为数众多的结肠小袋纤毛虫包囊。包囊为休眠期虫体，呈球形或卵圆形，灰黄或淡绿色，无纤毛，不运动，有2层囊膜，外膜较内膜稍厚，有时还可见到处于脱水浓缩期的包囊，其染色结果见中插彩版图2～5。羊结肠小袋纤毛虫包囊美蓝染色30 min，囊膜不着色，呈红色，在囊膜外残留的滋养体期的外膜呈淡蓝色，外质淡蓝色，内质深蓝色，食物泡和伸缩泡呈淡蓝色，胞核呈深蓝色(中插彩版图2)。羊结肠小袋纤毛虫包囊2%碘液染色30 min，胞膜不着色，呈红色，内质深黄色，外质、伸缩泡和胞核呈土黄色(中插彩版图3)。羊结肠小袋纤毛虫包囊瑞氏染色24 h，囊膜外层淡蓝色，内层为淡红色，外质淡红色，内质、食物泡和胞核呈紫红色(中插彩版图4)。羊结肠小袋纤毛虫包囊苏木素染色12 h，胞浆呈黄色，胞核淡红色；染色24 h，胞浆粉红色，食物泡和胞核呈深紫红色(中插彩版图5)。包囊的染色时间远远多于滋养体，说明包囊膜结构致密，通透性差，不易着染，而滋养体由于有胞口和胞肛的存在，通透性强，易于染色。

2.4 药物敏感性试验结果 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果见表1。

表1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果

判定标准：无羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(-)，有羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(+)

本药敏试验中，血虫净、土霉素片、盐酸左旋咪唑、复方新诺明、痢特灵和氨苄青霉素钠对羊结肠小袋纤毛虫滋养体的绝对致死浓度LC100分别为：0.195 mg/mL、0.391 mg/mL、3.125 mg/mL、12.5 mg/mL、50 mg/mL和50 mg/mL，丙硫苯咪唑和乳酶生在浓度小于50 mg/mL时对羊结肠小袋纤毛虫滋养体无效，甲硝唑和中药驱虫净散在浓度低至0.025 mg/mL时，仍然杀灭了全部的结肠小袋纤毛虫。本试验显示，药物治疗结肠小袋纤毛虫病时，甲硝唑治疗效果优于血虫净，这与刘翠等人的研究结果一致[9]。

2.5 药物防治试验结果 甲组病羊治疗后第7天，除1只母羊仍有轻微腹泻症状，1只4月龄羔羊死亡外，其余均无明显症状，粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性，粪便转阴率为73.33%(11/15)，继续治疗6 d后，全部康复，治愈率为93.33%(14/15)。乙组病羊治疗后第10天，有2只母羊仍有轻微腹泻症状，其余均痊愈，且末出现死亡病例，粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性，粪便转阴率为80%(12/15)，继续治疗6 d后，全部康复，治愈率为100%(15/15)。结果可以看出，用甲硝唑和中药驱虫净散治疗羊结肠小袋纤毛虫病，均取得显著疗效，但治疗时一定要保证药物的剂量和疗程，确保粪便中羊结肠小袋纤毛虫全部被杀死，防止疾病反复。

3 讨论

3.1 粪便中羊结肠小袋纤毛虫的分离、固定与染色 粪便中含有纤维素、细菌、蛋白质、沙粒等异物，会影响羊结肠小袋纤毛虫的制片和观察的效果。新鲜粪便经直接涂片发现羊结肠小袋纤毛虫后，可采用生理盐水1 500 r/min离心水洗3～5次，再用2.5%戊二醛固定，可以洗掉虫体表面和纤毛上吸附的蛋白质等异物。离心管中进行染色、脱水后制片观察，可以避免染色和脱水时，虫体(特别是包囊)易脱落的现象。如染色过深，常规的做法是用1%盐酸乙醇脱色，其脱色的时间很短，很难操作和控制，特别是在离心管中染色时更难，另外，脱色后虫体颜色发灰发暗，很难染出色泽艳丽、层次分明的标本，如采用反复水洗脱色，可达到理想的染色效果。

3.2 药物对结肠小袋纤毛虫滋养体的杀灭试验 本试验建立了羊结肠小袋纤毛虫滋养体的药物敏感性试验方法，该方法将药液在平底96孔细胞培养板上进行倍比稀释，与等量的结肠小袋纤毛虫滋养体培养悬液混合，28 ℃作用12 h，在倒置显微镜下观察结果，测定药物的致死浓度(LC100)，该方法简便、快捷、直观和实用。临床上也可以直接将新鲜粪便加液体培养基搅匀，粪网筛过滤，必要时进行离心浓集，制成滋养体悬液进行试验，以选出兽医临床防治的有效药物。

试验结果显示, 甲硝唑具有较好的抗羊结肠小袋纤毛虫滋养体活性效果，可用作临床的首选治疗药物，其次是血虫净和土霉素，这与抗猪结肠小袋纤毛虫滋养体的试验结果一致[9-10]。中药驱虫净散对结肠小袋纤毛虫滋养体的LC100浓度低至0.025 mg/mL，优于其他常山、青蒿等中草药制剂[11]，同时中药驱虫净散具有抗线虫、绦虫和球虫等活性，有广阔的应用前景。

3.3 羊结肠小袋纤毛虫的药物治疗 目前，以甲硝唑为代表的硝基咪唑类药物是抗滴虫、阿米巴原虫和结肠小袋纤毛虫的首要选择，但其具有潜在的致癌和致突变作用[12]，而且容易产生耐药性，因此开发安全、有效、绿色的甲硝唑类药物的替代品已成为必然。本文治疗羊结肠小袋纤毛虫的中药驱虫净散以其广谱、高效、安全的特点，有较高的推广价值。本病治愈后，依然存在摄入结肠小袋纤毛虫包囊的可能性，所以羊场一旦发生该病，就很难清除，要加强饲养管理，定期检查和驱虫，做到早诊断，早治疗。

4 小结

通过临床检查，粪便实验室检验和粪便水洗沉淀物染色镜检等措施，首次确诊了以患严重腹泻症状为特征的羊结肠小袋纤毛虫病例，中西医药敏试验和治疗试验发现，甲硝唑和中药驱虫净散具有较好的治疗效果，其中中药驱虫净散绿色环保、不易产生耐药性，具有广阔的应用前景。