人乳头瘤病毒18型融合蛋白和重组痘苗病毒联合免疫的效果评价

赵莉 任皎 冯靖 庞正 黄盼盼 赵颖 谭文杰 阮力 田厚文

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室（赵莉、任皎、庞正、黄盼盼、赵颖、谭文杰、阮力、田厚文）；100176北京生物制品研究所有限责任公司（冯靖）

癌症在导致人类死亡的死因中排名第二，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）相关的癌症占人类癌症的4.5%，其中宫颈癌是造成女性死亡的第四位恶性肿瘤［1-2］。生殖道的高危人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的发生密切相关，99.7%的宫颈癌患者的宫颈样本中能够检测到高危人乳头瘤病毒，其中HPV16和HPV18可占全部病例的73%［2］。感染HPV18主要引起宫颈腺癌［3］，其病变组织多位于子宫颈口内，宫颈刮片筛查时不容易被检测到，病情进展较快且容易转移，预后较差。因此，研制HPV18型别的疫苗对预防HPV18感染及相关肿瘤的治疗具有重要意义。

治疗性疫苗的目标在于诱发机体产生强的细胞免疫应答，将已感染HPV的细胞或已整合HPV DNA的细胞杀伤，从而控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶。 HIV［4］、疟疾［5］、HPV16［6-8］等多种疫苗在研发过程中显示单一疫苗诱导机体产生的免疫水平较低，而利用prime-boost免疫策略可以显著激发机体产生特异性免疫应答，尤其是细胞免疫应答。本课题组曾用HPV16型蛋白疫苗初次免疫、重组痘苗病毒加强免疫策略可明显提高疫苗的细胞免疫水平、保护免疫小鼠免受相应肿瘤细胞的攻击［8］。为了解HPV18型疫苗的免疫效果，本研究用原核表达系统表达并纯化的HPV18L231-600E7E6融合蛋白与表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒进行不同免疫程序的联合免疫效果评价，获得了能诱发较高水平的细胞免疫和体液免疫的联合免疫程序，为进一步探索最佳的HPV联合免疫提供了坚实的前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、病毒 pMD18-T载体为 TaKaRa公司产品，pET9a表达载体为Novagen公司产品；大肠埃希菌BL21（DE3）、DH5α均由本室保存；重组痘苗病毒rVV18E7E6是在天坛株J片段TK区内重组有HPV18E7E6融合基因和LacZ基因，重组痘苗病毒rVV1175是在天坛株J片段TK区内重组有LacZ基因，由本室构建；表达HPV18L1、L2衣壳蛋白的假病毒由本室制备，其包装质粒由美国国家癌症研究所John T.Schiller教授馈赠。

1.2 抗原、抗体、多肽及其它重要生化试剂HPV18L2、E7和 E6原核表达并纯化的蛋白和HPV18L2蛋白的小鼠多抗由本室制备，HPV18E6、E7蛋白的山羊多抗为Santa Cruz公司产品，辣根氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠和兔抗羊IgG购自北京中杉生物技术有限公司，mouse IFN-γELISPOT试剂盒为 BD 公司产品，HPV18E667-75（KCIDFYSRI）多肽［9］和 HPVE7 肽库（18E7all，15 个氨基酸一条肽段，重叠11个氨基酸）由北京中科亚光生物科技有限公司合成。CpG1826佐剂（5’-TCCATGACGTT CCTGACGTT-3’）由TaKaRa公司合成，镍离子亲和层析柱为GE公司产品。

1.3 设计并构建密码子优化的HPV18L231-600E7E6基因的原核表达质粒 选用从宫颈癌患者分离获得的HPV18序列，经序列比对与 GenBank中的AY262282序列一致。将次要衣壳蛋白L2的第31-600位核苷酸序列（L231-600）与早期蛋白E7、E6核苷酸序列融合（删除E7、E6的起始密码子和E7的终止密码子），并将E7、E6蛋白与致癌位点相关的氨基酸进行突变：E7蛋白第27、29位的Cys、Glu和E6蛋白第65位的Cys分别突变为Gly，利用基因简并性，在保持氨基酸序列不变的前提下设计出适于在大肠埃希菌中表达的密码子优化的核苷酸序列HPV18L231-600E7E6，该序列表达的融合蛋白共451个氨基酸。此融合基因由北京擎科生物技术有限公司分开合成：pGH-18-33含有HPV18L2蛋白的第1-600位核苷酸基因片段，pGH-18E7E6P含有HPV 18L2基因的第586-600位核苷酸基因片段和E7E6融合基因。

以pGH-18-3为模板进行PCR，扩增L231-600基因片段并插入克隆载体pMD18-T构建出pMDH PV18L231-600质粒。然后以酶切后pMDHPV18L231-600质粒和pGH-18E7E6P质粒为模板，用重叠PCR方法扩增出含NdeⅠ、BamHⅠ酶切位点以及6个组氨酸的 HPV18L231-600E7E6目的基因，并构建获得pMDHPV18 L231-600E7E6克隆质粒。然后将目的基因与经相同酶消化的pET9a载体连接，筛选获得原核表达质粒pETHPV18L231-600E7E6。

1.4 HPV18L231-600E7E6蛋白的表达鉴定及纯化将质粒 pETHPV18L231-600E7E6转化 BL21（DE3）大肠埃希菌。取适量菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳，进行考马斯亮蓝染色分析或Western blot鉴定。高表达的菌株用IPTG诱导收获菌体，将沉淀重悬于40 ml裂解缓冲液（20 mmol／L Na2HPO4，0.5 mol／L NaCl，pH7.5），经超声裂解后，2 mol／L 尿素洗杂蛋白，8 mol／L尿素悬起，离心取上清，经镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白，最后透析至PBS缓冲液，超滤离心浓缩，储存于-70℃。

1.5 实验动物和免疫程序 C57BL／6（H-2b）雌性小鼠，6～8周龄，购自中国医学科学院实验动物繁育中心，在二级动物生物安全实验室饲养。每组5只小鼠，免疫组用不同的初免-加强模式，分别免疫HPV18L231-600E7E6／CpG（蛋白 50 μg／只，佐剂 CpG 10μg／只，混合后于小鼠左后下肢肌注），rVV18 E7E6（107pfu／只，腹腔注射），同时设阴性对照组PBS（100 μl／只，肌肉注射），病毒对照组 rVV1175（107pfu／只，腹腔注射）。免疫程序见表1。

表1 18L231-600E7E6融合蛋白与重组痘苗病毒rVV18E6E7联合免疫程序Tab.1 The combined immunization procedure of 18L231-600 E7E6 fusion protein and recombinant vaccinia virus rVV18E6E7

1.6 不同联合免疫方案所诱导的体液免疫和细胞免疫反应

1.6.1 结合抗体检测：ELISA分别检测血清的HPV18L2、E7和 E6结合性抗体。 100 ng／孔的 L2、E7和E6抗原4℃包被过夜，封闭后加入血清进行检测。血清从1∶50开始稀释，以PBS组小鼠血清为阴性对照，相同稀释度下实验组血清的OD值等于或大于2.1倍 PBS组血清的 OD值时定义为阳性。

1.6.2 中和抗体检测：假病毒中和实验进行血清的HPV18 L2中和抗体检测。将稀释的血清与200～300个TCID50的假病毒（表达HPV18L1、L2衣壳蛋白）混合均匀，4℃放置1 h后加入96孔细胞培养板培养的293FT细胞中，37℃、5%CO2孵箱中培养2 d，倒置荧光显微镜下观察，计算绿色荧光点数，各血清从1∶20开始稀释，抑制率大于50%的最大稀释倍数的倒数作为血清的中和滴度。

1.6.3 细胞免疫反应检测：取脾细胞，ELISPOT检测E7肽库和E667-75单肽刺激产生的特异性分泌IFN-γ的效应 T细胞数，具体操作参见 BD公司ELISPOT试剂盒说明书，形成的斑点数用Bioreader 4000（德国）分析仪进行读数，将脾细胞调整至1×106进行统计分析。特异性斑点数＝实验孔斑点数-相应小鼠未加肽刺激的对照孔，当特异性斑点数≥10／106cell定义为抗原特异性T细胞反应。

1.7 统计学方法 所有数据用均数和标准差表示，用GraphPad Prism 5.01做图和统计分析。比较不同组别小鼠免疫反应水平时，均数用 Two-way ANOVA检验进行分析，

2 结果

2.1 HPV18L231-600E7E6融合蛋白的表达、纯化和鉴定 pETHPV18L231-600E7E6质粒转化的BL21（DE3）大肠埃希菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE凝胶分析：在相对分子质量约51×103处可见明显新增表达带，大小与理论值一致。Western blot鉴定结果表明该条带与HPV18L2、E7和E6多抗均有特异性反应，说明HPV18L231-600E7E6蛋白在原核系统中正确高效表达，结果见图1。

A：HPV18L231-600 E7E6的原核表达和纯化；B.Western blot鉴定；M：蛋白 Marker；1：pET9a 转化的全菌蛋白；2：pETHPV18L231-600 E7E6转化的全菌蛋白，3：纯化的融合蛋白图1 HPV18L231-600 E7E6融合蛋白的原核表达、纯化与鉴定A：Expression（left） and purification（right） analysis.B：Western blot assay.M：Protein marker，1.BL21（DE3）lysate transformed pET9a，2：BL21（DE3） lysate transformed pETHPV18L231-600 E7E6，3：the purified fusion proteinFig.1 Expression，purification and Western blot analysis of HPV18L231-600 E7E6 fusion protein

2.2 不同联合免疫方案所诱导的体液免疫和细胞免疫反应

2.2.1 结合抗体检测：以PBS组小鼠血清为阴性对照，ELISA检测结果（图2）显示，各免疫组均能诱导小鼠产生相应抗原的特异性抗体，其中蛋白免疫组小鼠产生的特异性HPV18L2、E7和E6结合抗体滴度分别为844 485、83 651和147 033，明显高于其他免疫组（P＜0.001）；联合免疫组均高于重组痘苗病毒免疫组（P＜0.01）。病毒对照组rVV1175组小鼠没有检测到特异性抗体，血清滴度均小于50。

图2 不同免疫组小鼠诱发的结合性抗体滴度Fig.2 Detection of the specific antibody by ELISA in immunization mice（∗P ＜0.01，∗∗P ＜0.001）

2.2.2 中和抗体检测：次要衣壳L2蛋白可以诱发机体产生特异性中和抗体，假病毒中和实验结果（图3）显示，蛋白免疫组诱发的中和抗体滴度最高达到1 280，明显高于其他免疫组（P＜0.001）；痘苗病毒初免、蛋白加强免疫组检测到低水平的中和抗体，抗体滴度为80；而蛋白初免、痘苗病毒加强免疫组仅有1只小鼠检测到较低水平的中和抗体。

图3 不同免疫组小鼠诱发的中和抗体滴度Fig.3 Detection of the specific neutralization antibody in immunization mice（∗∗P ＜0.001）

2.2.3 细胞免疫反应检测：ELISPOT结果（图4）显示，各免疫组均能产生针对E667-75CD8＋表位肽刺激产生的特异性分泌γ-IFN的效应T细胞，蛋白初免、重组痘苗病毒加强免疫组检测到的T细胞数为1 202，明显高于其他免疫组（P＜0.001），其他免疫组间无差别（P＞0.05），PBS对照组和rVV1175痘苗病毒对照组未检测到有效的免疫反应，斑点数均小于5。对于E7肽库的刺激，所有小鼠均未检测到有效的免疫反应。

图4 不同免疫组小鼠ELISPOT检测T细胞免疫反应Fig.4 Detection of the specific T cell responses by ELISPOT in immunization mice（∗∗P＜0.001））

3 讨论

宫颈癌严重威胁着女性的健康，成功上市的疫苗目前用于未感染人群，且疫苗比较昂贵限制了接种人群的数量，这就造成了相当长时间内仍有大量的宫颈癌患者。HPV18型主要引起宫颈腺癌，恶性度较高，病情进展快且容易转移，因此迫切需要研制治疗性疫苗诱发机体产生强的细胞免疫应答，清除已感染HPV的细胞，从而控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶。考虑到HPV重度感染的患者体内病毒比较活跃，本研究除了选用E7、E6蛋白作为治疗性疫苗的靶抗原，同时选择了次要衣壳L2蛋白靶抗原，此蛋白虽然诱发的特异性中和抗体滴度与VLP相比较低，但不同型别L2蛋白的N端氨基酸序列高度保守，使其具备诱发产生交叉中和抗体的能力［10］，因此L2蛋白作为HPV广谱预防性疫苗的候选疫苗具有研发的潜力。同时考虑到融合蛋白太大不利于高效表达和纯化，本研究将L2蛋白截短仅保留含有中和抗体表位的第31～600位核苷酸序列与E7E6基因融合，用原核表达系统表达并纯化了HPV18L231-600E7E6融合蛋白。免疫两针融合蛋白的小鼠可以产生高水平的针对L2、E7和E6蛋白的特异结合抗体，以及能中和HPV18型假病毒的特异性中和抗体，与其他免疫组差异显著（P＜0.001），且产生的抗体能交叉中和HPV16和58型假病毒，抗体滴度均可达到1∶320。通过传统的重复免疫相同疫苗的免疫策略，很难诱发出高水平的细胞免疫反应，但应用不同来源的相同抗原进行初免-加强免疫策略，可以明显提高细胞免疫水平［4-6］。本研究用原核系统表达纯化的融合蛋白和重组痘苗病毒进行联合免疫，结果显示蛋白初免、重组痘苗病毒加强能够在小鼠体内诱发最强的T细胞免疫反应，与其他免疫组差异有统计学意义（P＜0.001），同时这种免疫程序也能诱发小鼠产生较高水平的结合性抗体，尽管仅有1只小鼠检测到中和抗体，可能是因为该免疫策略中起作用的L2蛋白仅免疫1次，且距离检测时间已有4周，提示在联合免疫中可以通过增加蛋白免疫次数获得更高水平的抗体水平和细胞免疫水平。此研究结果与HPV16型联合免疫结果一致［9］，提示针对HPV融合蛋白和重组痘苗联合免疫策略中，蛋白初免、重组痘苗病毒加强在诱发机体产生细胞免疫反应方面是最好的免疫程序，后续研究中将进一步探讨蛋白免疫两针、重组痘苗病毒加强的三针免疫策略是否能获得更强的细胞免疫和中和抗体免疫反应。尽管联合免疫可以明显提高小鼠的特异性细胞免疫水平，但在本研究中没有检测到有效的针对E7抗原的特异性T细胞反应，这与以前免疫重组痘苗病毒的结果一致［9］，进一步说明HPV18E7蛋白可能不能与小鼠来源的MHC分子有效结合并提呈。

总之，以融合蛋白 HPV18L231-600E7E6／CpG初免、重组痘苗病毒rVV18E7E6加强免疫的联合免疫策略，在小鼠体内可诱发高水平的18E667-75特异性的细胞免疫应答，同时可产生较高的结合性抗体水平，并能检测到低水平中和抗体，为治疗HPV18型慢性感染和宫颈癌手术后辅助治疗的疫苗研发提供实验依据。

利益冲突 无