乙型肝炎病毒X蛋白与线粒体延长因子G1相互作用

赵福河 焦佰海 焦伯延

272000济宁市疾病预防控制中心检验科（赵福河、焦伯延）；518000深圳市血液中心输血医学研究所（焦佰海）

乙型肝炎病毒 X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx） 是乙型肝炎病毒 （hepatitis B virus，HBV）X基因编码的154个氨基酸组成的16.5×103蛋白［1］。HBx蛋白功能广泛，可通过蛋白相互作用影响细胞增殖、细胞凋亡、细胞浸润和转移，在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生发展过程中发挥关键作用［2-4］。

线粒体延长因子G1（mitochondrial elongation factor G1，EFG1）是线粒体蛋白翻译系统的延长因子，控制线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）过程的I、III、IV和V等 4种复合体的13种蛋白的翻译［5-6］。这13种蛋白包括NADH脱氢酶 1（ NADH dehydrogenase 1，ND1）、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、细胞色素 b（ cytochrome B，CYB）、细胞色素 C 氧化酶 I（cytochrome C oxidase I，COX1）、COXII、COXIII、ATP 合成酶 6（ATP synthase 6，ATP6）和 ATP8［5］。 研究表明，ND5、ND6、COXI和ATP8等蛋白在HBV相关肝癌患者中均发生不同程度的基因变异［7-8］；此外，在HBV相关肝癌患者组织中 ND6、CYB、COX1、ATP6 的表达均降低［9］。然而，4种复合体的13种蛋白在HBV相关肝癌患者中发生改变的具体机制及对肝细胞癌的影响尚未阐明。

本研究构建真核表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1，在Huh7肝癌细胞中共表达 HBx蛋白与EFG1蛋白后，HBx蛋白与EFG1蛋白可以发生直接相互作用。为进一步阐明HBV致病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 CytoTrap酵母双杂交试剂盒（批号：217438）购自 Stratagene公司；TaqDNA Polymerase High Fidelity（批号：11304-011）、pcDNA3.1／myc-His（-）A 载体（批号：V855-20）、Anti-myc（批号：46-0603）和 Lipofectamine 2000（批号：11668-019）均购自Invitrogen公司；限制性内切酶 Xba I（批号：1093 A）、Hin dIII（批号：1060 A）和 T4DNA 连接酶（批号：2011 A）均购自 TaKaRa公司；Anti-FLAG（批号：1346 V） 购自 Sigma公司；Protein A＆G Agarose（批号：sc-2003）购自 Santa Cruz公司；Western及 IP细胞裂解液（批号：P0013）购自碧云天生物科技有限公司；pENTER-EFG1（批号：CH-891028） 购自维真生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CytoTrap酵母双杂交验证HBx蛋白与EFG1蛋白相互作用：参照CytoTrap操作说明书，将pMyr-EFG1和 pSos-HBx、pMyr-EFG1 和 pSos MAFB、pMyr-EFG1和pSosColI各300 ng分别共转化到cdc25Hα酵母，分别涂布于SD／Glucose（-UL）固体培养基，24℃培养4 d后，分别挑选3个克隆于50μl SD／Glucose（-UL）液体培养基，充分混匀后，取出4μl分别到2个SD／Glucose（-UL）固体培养基和2个SD／Galactose（-UL）固体培养基；其中1 个 SD／Glucose（-UL）和1个 SD／Galactose（-UL）固体培养基放在24℃培养4 d；另外1个 SD／Glucose（-UL）和1个 SD／Galactose（-UL）固体培养基放在37℃培养4 d。另外共转化pSos MAFB和pMyr MAFB、pSos MAFB和pMyr SB为CytoTrap酵母双杂交系统阳性对照；共转化pSos MAFB和pMyrLamin C、pSos Col I和pMyr MAFB为CytoTrap酵母双杂交系统阴性对照。

cdc25Hα酵母24℃时，酵母 Sos蛋白功能正常，酵母可以正常生长；但37℃时，酵母Sos蛋白功能异常，酵母不生长，然而如果HBx蛋白与EFG1蛋白（Gal诱导pMyr-EFG1载体EFG1蛋白在酵母中表达；Gal培养基上EFG1蛋白可以表达，并定位于细胞膜；但Glu培养基上EFG1蛋白不表达）相互作用，就可将pSos-HBx载体表达的Sos蛋白募集在酵母细胞膜上，37 ℃酵母可在 SD／Galactose（-UL）固体培养基生长；如HBx蛋白与EFG1蛋白不发生相互作用，37 ℃酵母在 SD／Galactose（-UL）固体培养基不生长。

1.2.2 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 真核表达载体的构建：以pENTER-EFG1为模板，使用上游引物： 5′-GCTCTAG AATGAGACTCCTGGGAGCTGCA-3′（下划线为 Xba I位点）和下游引物：5′-CCCAAG CT TGTTCTTGGCTTTTCCTTT-3’（下划线为 Hin dIII位点），PCR 扩增 EFG1（NM＿024996）全长基因片段，以Xba I和Hin dIII酶切位点克隆于pcDNA3.1／myc-His（-）A载体。 重组载体经 Xba I和 Hin dIII双酶切鉴定并经测序证实目的基因正确无误，命名为pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1。

1.2.3 HBx蛋白和EFG1蛋白在Huh7细胞中的表达：每孔接种50万Huh7细胞于6孔板，观察24 h后，pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 载 体、FLAGCMV-2-HBx载体各1μg分别转染Huh7细胞，另外转染 pcDNA3.1／myc-His（-）A、pFLAG-CMV-2 各 1 μg作为对照，48 h后，Western blot及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后电转移至PVDF膜上。Western blot检测采用的一抗是与目的蛋白融合表达的标签抗体，即Anti-myc或Anti-FLAG单克隆抗体（1∶1 000），封闭液、二抗、洗液及检测系统均采用WESTERNBREEZE试剂盒，操作按照试剂说明书进行。

图1 CytoTrap酵母双杂交法验证HBx蛋白与EFG1蛋白相互作用Fig.1 Confirmation of the interaction between HBx and EFG1 by the CytoTrap two-hybrid assay

1.2.4 免疫共沉淀验证HBx蛋白与EFG1蛋白的相互作用：将300万Huh7细胞接种10 cm细胞平板，24 h 以后，共转染 pcDNA3.1／myc-His（-）AEFG1载体和pFLAG-CMV-2-HBx载体各5μg，另外共转 染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 载 体 和pFLAG-CMV-2载体各5μg作为对照组。48 h后，Western blot及IP细胞裂解液裂解细胞30 min，取上清，分别加入 20 μl Protein A＆G Agarose、5 μg Anti-FLAG 和20 μl Protein A＆G Agarose、5 μg Antimyc抗体，4℃，5.6×10-3g，半径5 cm垂直旋转孵育过夜后，收集Protein A＆G Agarose，加入20μl 2×SDS蛋白上样缓冲液，经10%SDS-PAGE电泳后电转移至 PVDF膜上，分别用 Anti-myc（1∶1 000）和Anti-FLAG（1∶1 000）检测。

2 结果

2.1 CytoTrap酵母双杂交法证明HBx蛋白与EFG1蛋白相互作用 相互作用验证组和两组CytoTrap酵母双杂交系统阳性对照pMyr-EFG1和pSos-HBx、pSos MAFB 和 pMyr SB、pSos MAFB 和pMyr MAFB分别共转化到cdc25Hα酵母后，酵母在SD／Glucose（-UL）和 SD／Galactose（-UL）固体培养基24℃可生长，在SD／Glucose（-UL）固体培养基37℃不生长，但在 SD／Galactose（-UL）固体培养基37℃可以生长。而两组阴性对照和两组CytoTrap酵母双杂交系统阴性对照pMyr-EFG1和pSos MAFB、pMyr-EFG1和pSosColI、pSos MAFB 和 pMyrLamin C、pSos Col I和pMyr MAFB分别共转化到cdc25Hα酵母后，酵母在 SD／Glucose（-UL）和 SD／Galactose（-UL）固体培养基24℃可生长，在SD／Glucose（-UL）固体培养基和SD／Galactose（-UL）固体培养基37℃均不生长（图1）。结果说明HBx蛋白与EFG1蛋白发生了相互作用。

2.2 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 重组载体的鉴定 EFG1基因全长2 253 bp，编码751个氨基酸的蛋白，相对分子质量约为83.5×103。PCR扩增EFG1基因片段，克隆入真核表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）A，构建 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1重组载体，经Xba I和Hind III双酶切，鉴定正确，并测序证实目的基因正确无误。

2.3 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和 p FLAGCMV-2-HBx重组载体在细胞中表达鉴定 在pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 重组载体中，目的蛋白EFG1与载体编码的myc多肽（10个氨基酸，可被相应的抗体检出）融合表达，编码融合蛋白相对分子质量大约83.5×103。将 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 载体和对照载体 pcDNA3.1／myc-His（-）A分别转染到Huh7细胞中，提取细胞蛋白，用myc抗体Western blot检测，结果显示在相应相对分子质量处可检测到特异性条带，确定融合蛋白已经表达（图2）。

1：转染 pcDNA3.1／myc-His（-） A；2：转染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG；3： 转 染 pFLAG-CMV-2；4： 转 染pFLAG-CMV-2-HBx图2 Western blot检测EFG1-myc和FLAG-HBx融合蛋白在Huh7细胞中的表达1： pcDNA3.1／myc-His （-） A were transfected； 2：pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1； 3： pFLAG-CMV-2 were transfected；4： pFLAG-CMV-2-HBx were transfectedFig.2 Western blot analysis of EFG1-myc and FLAG-HBx fusion protein expressed in Huh7 hepatocytes

此外，在pFLAG-CMV-2-HBx重组载体中，目的蛋白HBx与载体编码的FLAG多肽（8个氨基酸，可被相应的抗体检出）融合表达，编码蛋白分子质量大约16.5×103。将 pFLAG-CMV-2-HBx载体和对照载体pFLAG-CMV-2分别转染到Huh7细胞中，提取细胞蛋白，用FLAG抗体Western blot检测，结果显示在相应分子量处可检测到特异性条带，确定融合蛋白已经表达（图2）。

2.4 免疫共沉淀确证HBx与EFG1蛋白的相互作用 为了确证HBx蛋白和EFG1蛋白在肝细胞内的相 互 作 用， pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和pFLAG-CMV-2-HBx共转染Huh7细胞，另外共转染pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2 作为阴性对照，48 h后提取蛋白，用Anti-FLAG偶联的Protein A＆G Agarose进行免疫沉淀，用Anti-myc进行Western blot检测，发现FLAG-HBx蛋白可以把EFG1-myc沉淀下来（图3）。

此外，用 Anti-myc偶联的Protein A＆G Agarose进行免疫沉淀，用Anti-FLAG进行 Western blot检测，发现EFG1-myc蛋白可以把FLAG-HBx沉淀下来（图3）。说明HBx蛋白和EFG1蛋白的相互作用在细胞内确实存在。

3 讨论

1、3：转染 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2；2、4：转染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2-HBx图3 免疫共沉淀确证HBx与EFG1蛋白的相互作用1， 3： pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 and pFLAG-CMV-2 were transfected； 2， 4： pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 and pFLAGCMV-2-HBx were transfectedFig.3 Co-IPassay of the interaction between HBx and EFG1

CytoTrap酵母双杂交是一种经改进准确、高效的酵母双杂交方法，主要优点是研究的蛋白经过翻译后修饰，检测的相互作用发生在细胞质，更适合于研究具有转录功能的蛋白，随着酵母双杂交方法不断改进，假阳性率逐渐降低。免疫共沉淀技术是验证蛋白质之间特异性相互作用的一种经典方法，其研究的蛋白相互作用是细胞内自然存在的相互作用蛋白复合体，是验证蛋白相互作用的极为有效的可信方法。本研究利用CytoTrap酵母双杂交筛选与HBx蛋白相互作用肝细胞蛋白，获得1个新的蛋白即EFG1，并经CytoTrap酵母双杂交和免疫共沉淀方法进一步证明HBx蛋白与EFG1蛋白存在直接相互作用。目前，国内外尚无HBx蛋白与EFG1蛋白相互作用的报道。

HBx蛋白在HBV诱发的HCC过程中发挥关键作用，HBx蛋白能够直接结合并抑制P53蛋白进而促进细胞增殖并诱导肿瘤的发生［10］；HBx蛋白能够通过活化核因子-κB、无翅型MMTV整合位点家族、缺氧诱导因子-1α、转化生长因子-β等多种信号通路影响细胞周期蛋白-D1、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-8等多种肿瘤相关基因的表达，促进肝细胞肿瘤的增殖、侵袭和转移［11-12］；HBx蛋白可通过增强Bcl2关联X蛋白蛋白转位到线粒体、促进活性氧簇的产生、抑制Bcl-2样蛋白1表达等多种线粒体途径诱导肝细胞凋亡［10，13］。 此外，HBx 蛋白不改变核编码的OXPHOS过程相关蛋白表达，但可以通过特异下调线粒体DNA翻译控制的I、III、IV、V 4种复合体相关蛋白的表达，抑制OXPHOS，促进肝细胞凋亡［14］。

EFG1蛋白是线粒体DNA翻译的关键因子，肝脏EFG1蛋白异常，将阻碍线粒体DNA编码的13种蛋白合成，导致 I、III、IV、V 4种复合体的活性降低、OXPHOS抑制及能量代谢缺陷，引发肝脏功能障碍［15-17］ 。

HBx蛋白不改变 COXIII的 mRNA 含量［18］，但可以改变COXIII等线粒体DNA翻译的蛋白表达［14］，但是至今仍未有相关机制的研究；在HBV相关肝癌患者组织中线粒体DNA翻译的蛋白表达降低［9］，而具体原因仍无研究报道。本研究将为探讨HBx蛋白可能通过直接结合EFG1蛋白影响线粒体蛋白翻译系统，导致线粒体DNA翻译的蛋白表达降低、OXPHOS抑制、肝细胞凋亡，引发肝细胞癌并导致HBV相关肝癌患者中线粒体DNA翻译蛋白的降低提供研究依据。但是，本研究仅进行了HBx蛋白与EFG1蛋白相互作用的初步研究，而HBx蛋白通过EFG1蛋白对线粒体DNA翻译的影响和对HCC发生发展的影响仍未清楚，目前相关研究正在进行之中。

利益冲突无