EGCG抑制HBV复制的分子机理研究

王平 刘国辉 詹森林 袁静 吴其恺

518112深圳市第三人民医院

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶中茶多酚的主要组成成分。在干的绿茶叶子中，EGCG的含量占据所有茶多酚的59%左右［1］。EGCG具有广谱抗病毒作用，可有效抑制乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）、寨卡病毒（zika virus，ZIKV）、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等多种病毒的复制［1］。 在抗 HBV方面，有研究报道，EGCG可阻止 HBV与其受体NTCP 结合［2］，并抑制 HBV DNA 复制、HBV RNA 和HBV cccDNA合成等多个过程［3-4］。然而，EGCG调控宿主细胞因子，进而抑制HBV复制的分子机理却鲜 有 报 道［5］。 HNFs（hepatocyte-enriched nuclear factors）是宿主肝细胞中调控基因表达的一类转录因子的总称。有研究报道，在众多的HNFs蛋白亚型中，HNF4α在HBV复制的细胞模型中表达上调，并促进HBV的复制［6］。考虑到EGCG可调控基因转录［7-9］，此次研究了EGCG对HNF4α表达的影响以及HNF4α在EGCG介导的抗HBV信号通路中的作用。研究发现：（1）EGCG显著下调HepG2.2.15细胞中HNF4α的表达；（2）在Hep.2.15细胞中，利用siRNA沉默HNF4α的表达，显著降低HBV DNA的含量；（3）在 siRNA介导的 HNF4α沉默的细胞中，EGCG对HBV复制的抑制作用变弱。综上所述，本研究提示，EGCG通过下调HNF4α的表达可能是其发挥抗HBV作用的一种重要途径。

1 材料与方法

1.1 材料 EGCG（CAS：989-51-5）购自百灵威科技公司；CCK-8检测试剂盒（C0037）购自Beyotime公司；GAPDH 抗体 （＃5174）和 HNF4α 抗体（＃3113）购自 Cell Signaling Technology公司；特异沉默 HNF4α 编码基因的 siRNA（siRNA ID：144546）和对照 siRNA（siRNA ID：142980）采购自 Thermo Fisher公司；引物购自上海生工；逆转录试剂和荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素、胰蛋白酶、Opti-MEM培养基、转染试剂 lipofectamine 2000购自Thermo Fisher公司；细胞培养板购自康宁公司。

1.2 Hep G2.2.15细胞的培养 HepG2.2.15细胞接种于DMEM细胞培养基（DMEM＋10% 胎牛血清＋1% 青霉素和链霉素）中，置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3 EGCG处理Hep G2.2.15细胞 EGCG溶解于DMSO中，4℃ 避光保存。HepG2.2.15细胞培养24 h后，去除细胞培养基，并用PBS洗两遍。在细胞培养板中加入含有25μmol／L EGCG的DMEM细胞培养基，于37℃细胞培养箱中培养48 h，分别收集细胞培养基和细胞备用。

1.4 基因沉默实验 将HepG2.2.15细胞接种于不含抗生素的DMEM培养基中（DMEM＋10%FBS）培养12 h，用PBS缓冲液清洗细胞两次后将细胞培养基换成Opti-MEM。每个12孔中Opti-MEM的体积为0.5 ml。在细胞转染时，每个孔的siRNA用量为80 pmol，lipofectamine 2 000的用量为1.5 μl。加入转染试剂后，在37℃ 细胞培养箱中培养6 h，然后在每个孔中补加Opti-MEM，至终体积1 ml。继续在37℃ 细胞培养箱中培养细胞48 h后，分别收集细胞和培养基，进行下一步实验。

1.5 HBV病毒颗粒的纯化和检测 HBV病毒颗粒的纯化参照前人发表的文章［10］。根据HBV病毒颗粒在细胞内和细胞外分布的不同，HBV DNA的提取步骤稍有不同。细胞培养基中HBV病毒颗粒的纯化步骤如下：收集细胞培养基，2 000×g离心力的条件下，室温离心2 min，去除细胞残渣。在500 μl的细胞培养基中，加入等体积的沉淀剂（20%PEG 8000 ＋1.5 mol／L NaCl），4 ℃过夜沉淀，16 000×g离心30 min，所得沉淀即含有HBV颗粒。将HBV 颗粒重悬于缓冲液中（40 mmol／L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol／L MgSO4，1 mmol／L CaCl2），并加入DNase I（终浓度为2U），37℃水浴加热30 min后，65℃加热10 min。在上述溶液中加入10%体积的2%的 SDS和蛋白酶 K（终浓度为 0.5 mg／ml），55℃ 水浴加热1 h后，用磁珠法纯化HBV DNA（详见天根磁珠纯化试剂盒DP710说明书）。细胞中的HBV病毒颗粒的纯化方法如下：细胞经RIPA裂解液（碧云天）裂解后，于12 000×g离心力下离心30 min，取上清液200μl，加入等体积的沉淀剂沉淀。后续操作与培养基中HBV颗粒的纯化方法相同。通过荧光定量PCR的方法检测HBV DNA的含量。HBV特异性引物序列参照文献［10］，具体序列如下： HBV-f（5’-AGTGTGGATTCGCACTCCT-3’），HBV-r（5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTG-3’）。PCR反应体系和方法参照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书。

1.6 RNA的提取、逆转录以及HNF4αmRNA水平检测 本研究中，采用相对荧光定量PCR的方法，检测 HNF4α在转录水平的相对含量。利用TRIZOL试剂提取细胞中的总 RNA，经逆转录（TaKaRa，RR047a）合成cDNA。荧光定量 PCR所用的引物序列参照文献［6］，具体序列为：HNF4α-f（5’-CAGGACCCACCAGACACGTC-3’）， HNF4α-r（5’-TCGAGGCACCGTAGTGTTTG-3’）， GADPH-f（5’-GATTCCACCCATGGCAAATTCCA-3’）， GAP DH-r（5’-TGGTGATGGGATTTCCATTGAT GA-3’）。荧光定量PCR参照TaKaRa荧光定量PCR试剂（RR82LR）说明书进行。

1.6 Western blot实验 细胞经RIPA裂解液裂解后，4℃，16 000×g离心30 min。利用12%的SDSPA GE胶分离蛋白质并转移到PVDF膜上。用含有5%脱脂牛奶的PBS过夜封闭。一抗按照1∶1 000的比例稀释，二抗按照1∶5 000的比例稀释，经过显色、曝光、压片步骤后，检测 HNF4α、GAPDH的含量。

A：细胞活性实验（CCK-8）；B：细胞内HBV DNA相对含量（QPCR）；C：细胞外HBV DNA相对含量（QPCR）图1 EGCG处理降低细胞内外HBV DNA的含量A： Cell viability was analyzed by CCK-8 Kit； B and C： In vivo and in vitro HBV DNA level was tested by QPCRFig.1 EGCG treatment significantly decrease HBV DNA amount both in vivo and in vitro

2 结果

2.1 EGCG显著抑制HBV复制 首先研究EGCG对HepG2.2.15细胞复制的影响。如图1 A所示，与对照组（DMSO）相比，经25μmol／L的 EGCG处理48 h后，细胞活力不受影响。实验结果表明，25 μmol／L的 EGCG对 HepG2.2.15细胞没有毒性。接下来研究EGCG对HBV复制的影响。如图1B和1C所示，与对照组相比，EGCG处理HepG2.2.15细胞48 h后，细胞内外HBV DNA的含量显著下降，表明EGCG显著抑制HBV复制。

2.2 EGCG显著下调HepG2.2.15细胞中HNF4a的含量 研究表明，在HBV复制的肝细胞中，转录因子 HNF4α表达上调并促进 HBV DNA复制［6］。考虑到EGCG可调控基因转录，且EGCG调控HNFs的研究尚未有报道，此次研究了EGCG对转录因子HNF4a的调控作用。如图2 A和2B所示，分别利用荧光定量 PCR和 Western blot方法检测了HepG2.2.15细胞中HNF4αmRNA和蛋白表达水平。研究发现，EGCG处理显著降低HNF4α的表达，表明EGCG处理可显著下调宿主细胞中HNF4α的表达。

2.3 沉默HNF4a编码基因的表达导致EGCG抗HBV作用减弱 进一步研究了HNF4α在EGCG介导的抗HBV信号通路中的作用。利用siRNA沉默HNF4α的表达后，研究了HNF4a沉默表达对EGCG抗HBV作用的影响。如图3 A和图3B所示，沉默HNF4α的表达后，EGCG抗HBV复制作用显著减弱，表明EGCG通过下调HNF4α的表达，抑制HBV复制。

A：利用荧光定量PCR方法检测HNF4αmRNA相对含量；B：利用Western Blot检测HNF4α的蛋白表达水平图2 EGCG下调HepG2.2.15细胞中HNF4α的表达A：HNF4α mRNA expression was tested by QPCR；B：Western Blot was used to test HNF4α protein expressionFig.2 EGCG treatment down regulates HNF4αexpression in HepG2.2.15 cells

A：利用siRNA沉默HNF4a的表达；B：沉默HNF4α基因表达后，用荧光定量PCR方法检测细胞内外HBV颗粒中DNA的含量图3 沉默HNF4a基因表达后EGCG抗HBV作用显著减弱A： HNF4α knock down was tested by western blot；B：HBV titers level was tested by QPCRFig.3 EGCG mediated anti-HBV role decreased significantly upon HNF4a knock down

3 讨论

作为绿茶中含量最多的茶多酚，EGCG具有广谱抗病毒作用。EGCG抑制HBV DNA复制作用，此前已经有大量文献报道。比如，Xu等［4］以HepG2-N10为细胞模型，研究了EGCG的抗HBV作用。研究发现，EGCG处理可显著抑制HBV的复制和转录并降低HBsAg和HBeAg的含量。亦有研究者发现，低浓度的EGCG 可抑制 HBV mRNA转录［3］，阻止HBV颗粒进入细胞［2］，或通过改变细胞微环境，阻止HBV复制［11］。然而，上述有关EGCG抗HBV作用的研究对象多集中病毒层面，很少涉及到EGCG对宿主细胞内在因子的影响。有研究发现，HCV非结构蛋白NS5A与HSC70相互作用，并招募HNF1α形成复合体结构，进而调控HNF1α的表达和以及HCV的复制［12］。在这一过程中HNF1a是促进HCV复制的关键细胞因子。考虑到EGCG同时具有抗 HCV作用［13］，且在乙肝细胞模型中，HNF1α与HNF4α协同作用，此次研究了HNF4α在EGCG抗HBV信号通路中的作用。

HNF4α是HNFs家族成员中唯一的促进HBV复制 的 转 录 因 子［6］。 Raney 等［14］研 究 发 现， 在HepG2.1细胞中过表达HNF4α，可使HBV preS1转录水平提高9倍。而Yu等［15］研究发现，在肝细胞HuH7中，过表达HNF4α则会增加pgRNA的表达至原来的14倍。这些研究显示，HNF4α是细胞中重要的抗HBV因子。本研究利用HBV复制的细胞模型HepG2.2.15，研究了EGCG对HBV复制的影响。研究发现 EGCG可下调 HNF4α表达，并且抑制HBV DNA复制。利用siRNA沉默HNF4α的表达后，EGCG介导的抗 HBV作用几乎消失，表明HNF4a是EGCG抗HBV信号通路中的重要细胞因子。 利用基因敲除实验，Yu等［15］发现，HNF4α 可结合到HBV的基因组上，进而调控基因表达。其中HBV基因组上preS1和核心蛋白的两个编码区（nt1992-2435和 nt2830-3068）是 HNF4α的结合位点［16］。这一结果提示，EGCG介导的HNF4a的表达下调，可能会减少HNF4α与HBV基因组结合，进而降低HBV基因的转录，相关实验正在开展中。值得注意的是，EGCG在细胞中稳定性是限制其成药的一个重要的因素，因此科学工作者开发了大量的EGCG类似物以增加其稳定性［1］。这些EGCG类似物是否具有更好的抗HBV作用，未来值得探索。另外，考虑到EGCG的毒副作用较小，我们拟在接下来的工作中探索EGCG和核苷类药物联合用药的可能性。

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