恒温扩增荧光检测技术在基层结核病实验室的应用价值

马晓光 郑丹薇 朱岩昆 石洁 王少华 李辉

结核病发病率及发布例数一直居于我国法定报告乙类传染病的前列；肺结核是由结核分枝杆菌引起的肺部慢性传染性疾病，严重危害人类的身体健康[1-3]。结核病的病原学检测是结核病确诊和治疗的主要依据，也是发现传染源的主要途径。目前，我国肺结核的实验室检测主要依靠痰涂片(染色镜检)和痰培养。然而，传统的痰涂片检测敏感度低，且无法区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌[4]，而痰培养方法虽有较高的敏感度和特异度，但检测周期长、易发生污染，无法满足临床检测的实际需要。因此，寻求简便快速、敏感度高、特异度强的检测方法成为临床结核病诊断的当务之急。本研究采用恒温扩增荧光检测技术，对4276例疑似肺结核患者的痰标本分别进行痰涂片、痰培养和恒温扩增荧光检测。以痰培养为标准，对比分析痰涂片和恒温核酸扩增荧光检测技术的敏感度、特异度及检测时间，评价恒温扩增荧光检测技术在基层结核病实验室中的应用价值。

材料和方法

一、研究对象

由于邓州市结核病防治所、永城市结核病防治所、中牟县卫生防疫站、新密市疾病预防控制中心等4个县级单位近年来一直参与结核病耐药性监测和“十二五”国家科技重大专项的研究，患者资料保存完整和实验室诊断技术完善，因此选取这4个项目点进行采样调查。2014年10月1日至2015年9月30日期间，4个项目单位共计纳入疑似结核病患者4336例，按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[5]中的要求收集痰标本，每例患者收集3份痰标本(即时痰、夜间痰、晨痰)，涂片后将3份痰标本混合后进行痰培养和恒温扩增荧光检测。剔除污染、信息不全、无临床诊断结果等患者，共纳入4276例患者的痰标本。

二、痰涂片抗酸染色显微镜检查

按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[5]中的要求对收集的患者痰标本进行痰涂片、染色和显微镜检操作；萋-尼染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

三、痰标本培养

采用简单法进行痰标本的培养。将患者痰液用4%氢氧化钠消化后，振荡处理并静置15 min后，用无菌一次性吸管接种于改良酸性罗氏培养基上。于37 ℃条件下进行培养，第3天和第7天各观察1次，此后每周观察一次并记录生长过程，培养至菌落生长或8周后报告无菌落生长。采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)生长试验进行菌种鉴定[6]。对生长菌落进行萋-尼染色，确认是否为抗酸杆菌。改良酸性罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

四、恒温扩增荧光检测

痰培养剩余痰液吸取1 ml至带盖离心管中，12 000×g离心5 min，去上清；加生理盐水1 ml，混匀，12 000×g离心5 min，去上清；加入100 μl DNA提取液，涡旋混匀15 s，煮沸10 min；12 000×g离心2 min，将制备好的DNA转移至新的离心管中备用。按照n+2(n个待检样本+阴性对照+阳性对照)配制扩增液，每管23 μl分装至PCR管中，将上述含有混匀试剂的PCR管中加入20 μl的密封液，随后在密封液面以下加入2 μl制备好的DNA及阴性对照和阳性对照，3000×g离心30 s；63 ℃反应45 min，由仪器自动判读结果。恒温扩增荧光检测仪、结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒等购自广州迪澳生物技术有限公司。

五、统计学处理

计数资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以痰培养为标准，计算恒温扩增荧光检测技术、痰涂片的敏感度和特异度，使用Kappa检验评估痰涂片、恒温扩增荧光检测技术与痰培养的一致率。

六、伦理学审查

本研究由河南省疾病预防控制中心伦理委员会审核批准。参与此次研究的患者均签署知情同意书，并且整个研究阶段均遵循伦理原则。

结 果

一、总体检测结果

痰涂片检出阳性者351例，阳性检出率为8.21%(351/4276)；痰培养检出阳性者576例，阳性检出率为13.47%(576/4276)；恒温扩增荧光检测技术检出阳性者733例，阳性检出率为17.14%(733/4276)；以上3种检测技术的阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=153.412，P<0.001)。痰培养阳性中有34例恒温扩增荧光检测技术检测为阴性，采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)生长试验进行菌种鉴定，按照《分枝杆菌痰培养标准化操作程序及质量保证手册》的标准[6]，鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)。痰培养阴性中有233例恒温扩增荧光检测阳性，进行免疫学菌种鉴定(MPT64)且与临床诊断复核后，确诊为肺结核165例，肺部感染、肺炎等68例。

以痰培养为标准，痰涂片检测的敏感度为57.29%(330/576)，95%的可信区间为53.12%～61.35%；特异度为99.43%(3645/3666)，95%的可信区间为99.10%～99.63%；阳性预测值为94.02%(330/351)，阴性预测值为93.68%(3645/3891)；一致率为93.70%，Kappa值为0.679。 恒温扩增荧光检测技术法的敏感度为86.81%(500/576)，95%的可信区间为83.70%～89.40%；特异度为93.64%(3433/3666)，95%的可信区间为92.79%～94.40%；阳性预测值为68.21%(500/733)，阴性预测值为97.83%(3433/3509)；一致率为92.71%，Kappa值为0.722(表1)。痰涂片与恒温扩增荧光检测技术检测痰标本的敏感度差异有统计学意义(χ2=153.336，P<0.001)。

表1 痰涂片、恒温扩增荧光检测技术

注以痰培养为标准，分别计算痰涂片、恒温扩增荧光检测技术的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。计算公式如下：敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%；一致率=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+假阴性数+真阴性数+假阳性数)×100%，阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%；阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%

二、各县级结核病防治机构(简称“结防机构”)检测结果分析

对各个县结防机构采用恒温扩增荧光检测技术的检测阳性率进行比较，邓州市结核病防治所该方法检测阳性率为28.14%；永城市结核病防治所该方法检测阳性率为13.71%；中牟县卫生防疫站该方法检测阳性率为14.36%；新密市疾病预防控制中心该方法检测阳性率为12.26%。从表2可以看出，4个项目点对3种检测方法的阳性检出率比较，差异存在统计学意义(P<0.001)，其中邓州市结核病防治所3种方法的阳性检出率均高于其他3个项目点，表明该项目点实验室检测能力相对较强。

三、检测完成时间的比较

痰涂片每份样本一般检出时间需要2 h，但检出率低，从我省数据显示不到13%。虽然痰培养与痰涂片比较可明显提高阳性检出率，但每份样本出报告的时间较长，需要将近2个月。恒温扩增荧光检测技术不仅与痰培养相比较具有较高的阳性检出率，而且检测时间较短，和痰涂片检测时间相近，每份样本检测的完成时间大约为2 h，且可以直接鉴定结核分枝杆菌复合群，因此在检测时间上与传统痰涂片和痰培养相比有较大的优势。

表2 各县级结核病防治机构采用3种方法的阳性检出率比较

讨 论

结核病仍是全球关注的公共卫生问题，全球约有1/3的人口是结核分枝杆菌感染者，且大多集中在发展中国家；结核病是成年人单一感染源致死的主要原因[6]。传统结核病诊断方法有痰涂片、痰培养。痰涂片操作简单、快捷，但对于含菌量较少的标本容易漏检；痰培养为检测分枝杆菌的标准，阳性检出率高于痰涂片法，但耗时较长，需2～8周才能报告结果，且痰涂片与痰培养均不能区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。

为了准确、快速地检测结核分枝杆菌，开展分子生物学检测已成为发展趋势。比如基于聚合酶链式反应技术的检测、基于分子膜杂交技术的检测，以及基于基因芯片技术的检测等[7-8]，但这些技术需要较高的专业知识和复杂的操作技术，并不适合于基层实验室的使用。恒温扩增技术是近年来迅速发展的一种检测手段，由于具有操作简单、检测快速、结果准确，以及扩增效率高于普通PCR、检测成本低廉等优势，受到了越来越多的关注。并且恒温扩增技术的反应条件与其他常规的核酸扩增方法相比，要求比较简单[9]。因为参与反应的嗜热脂肪芽胞杆菌(Bst)DNA聚合酶在较宽泛的pH值和温度范围内，均能保持较好的生物活性，且其对DNA模板的纯度要求较低。所以恒温扩增技术的整个反应体系具有更好的耐受度。近年来，已有研究者应用恒温扩增技术检测方法对结核病患者的临床标本进行快速诊断和评估[9-10]。

本研究使用恒温扩增荧光检测是将恒温扩增与实时荧光技术相结合，实现了结核分枝杆菌复合群的快速核酸扩增和自动化结果报告。该方法作为一种全新的体外快速诊断技术，通过Bst DNA聚合酶及结核特异性核酸片段的特异性引物，在恒温条件下对样本中结核分枝杆菌复合群的核酸片段进行特异性扩增，扩增产物(DNA)与核酸染料结合后发出荧光信号，通过实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读检测结果。本研究结果显示，该方法对结核分枝杆菌复合群检测的敏感度为86.81%，特异度为93.64%，并且该方法与痰培养检测结果的Kappa值为0.722，说明其与痰培养结果比较具有非常好的一致性。同时4个项目点的数据显示恒温扩增荧光检测与痰涂片和培养相比，明显提高了阳性检出率。由于该方法具有较好的敏感度和特异度，并且操作简单、生物安全性高、检测过程不易受干扰，因此可在基层实验室作为快速检测技术用于结核病的诊断。