大肠埃希菌与沙门菌纸基微流控联合检测试纸在沙门菌检测中的应用

郑晓风，郑晓琴，石 莉，刘英玉，姚 刚，张晓红

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

沙门菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌[1]，主要通过养殖场及周围的环境、肉及肉制品加工、运输及储存、销售等环节污染畜禽产品，当人误食沙门菌污染的食品，可引起恶心、发热、腹痛、腹泻及菌血症等症状，甚至死亡[2]。据相关数据显示，我国每年发生的细菌性食物中毒事件中，由沙门菌引起的食物中毒约占40%[3]。欧美和日本等国家沙门菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的第2位[4]。

目前，国内外常用的沙门菌检测技术包括传统方法(GB 4789.4-2016)[5]、免疫学方法[6]及分子生物学方法[7]，其中，基于传统沙门菌分离和鉴定方法是国内认可的金标准[8]，沙门菌阳性菌结果推测到病原体进一步鉴定约需6 d～7 d时间，虽检测结果准确，但无法避免耗时耗力的缺点[9]。基于抗原抗体相结合产生特异性非放射性免疫反应的方法，所需时间3 h～48 h即可完成样品检测，具有特异性强、敏感性高等优势[10]，但需要专业人员和设备完成多种类抗体的制备[11]。利用碱基配对原理的核酸探针杂交技术、快速扩增目的基因为检测原理的聚合酶链反应(PCR)技术，具有高灵敏度、强特异性、结果清晰等优势[12]，但易在试验操作过程中造成污染，从而产生假阴性或假阳性的结果。

多年来，沙门菌的快检技术已成为研究热点，如夏诗琪等建立一种同时联检5种典型沙门菌胶体金试纸条，成功检出增菌16 h～20 h的沙门菌，最低检测限为10 CFU/mL～100 CFU/mL[13]，具有操作过程简便、结果判定清晰等优势。但其检测灵敏度仍有待提高。邴欣等设计了只需目测法结合光热效应温差法，用于沙门菌的快速检测试纸条，最低检测限达到2.4×104CFU/mL和2.4×103CFU/mL。当前已有的食品中沙门菌检测方法通常大于16 h培养物的富集，结果的报告时间至少需要12 h[14]。研发一种快速、准确、便捷、低成本的实用检测试纸，为畜产品生产和质量安全控制一线的初步筛查及抽样检测提供一种“轻简”新技术，应用于生产一线。因此，本试验拟采用姚刚团队研发的大肠埃希菌与沙门菌纸基微流控联合检测试纸(E.coli+S.en-μPADs)与市售食品沙门菌快速检测试纸，用于检测畜禽产品生产加工环节沙门菌污染结果，从而完成E.coli+S.en-μPADs临床应用效果评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检样品 从新疆库尔勒市某农贸市场上采集的牛肉、牛胴体拭子、牛肉刀具拭子、牛肉称台拭子、羊肉、羊胴体拭子、羊肉刀具拭子、猪胴体拭子、猪肉案板拭子、猪肉刀具拭子、猪肉称台拭子、驴胴体拭子、驴肉刀具拭子、鸡肉案板拭子、鸡肉刀具拭子，共计40份样品。

1.1.2 菌株 标准肠炎沙门菌CVCC 3762菌株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 β萘酚辛酸酯(β-naphthyl caprylate)，Apollo Scientific公司产品；营养肉汤生物试剂、营养琼脂生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；无水乙醇分析纯，天津市大茂化学试剂厂产品；N，N-二甲基甲酰胺分析纯，天津市致远化学试剂有限公司产品；乳糖分析纯，天津永晟精细化工厂产品；绿洲市售食品沙门菌快速检测试纸，达元绿洲生化公司产品；E.coli+S.en-μPADs，新疆农业大学动物医学学院基础教研室提供；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；SW-CJ-2FD博迅净化工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司产品；4℃ BCD-219D冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；PL203电子天平，梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 新鲜牛羊肉样品无菌采自从新疆库尔勒市某农贸市场上销售的牛羊肉，迅速放入4℃运输箱保存，4 h内返回实验室进行病原检测。猪肉、驴肉、鸡肉胴体表面拭子及加工用具拭子样品从新疆库尔勒市某农贸市场上销售的猪肉、驴肉、鸡肉，用蘸有生理盐水的棉签无菌采集胴体、案板、刀具、称台表面，迅速放入装有300 mL/L甘油肉汤保存。

1.2.2 样品处理

1.2.2.1 新鲜牛羊肉样品处理 将采集的新鲜牛羊肉等按GB4789.4-2016[15]进行样品的前处理。无菌称取25 g肉样，放入盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶内，用手顺时针摇匀样品液时间持续1 min～2 min，制成1∶10的样品匀液。根据试验需求，依次将样品制成10倍递增系列稀释度的匀液。严格按照无菌操作进行，每递增稀释样液1次，需更换1次无菌吸管。密封锥形瓶放入36℃±1℃恒温箱，培养15 h。

1.2.2.2 猪肉、驴肉、鸡肉胴体表面拭子及加工用具拭子样品处理 将采集的300 mL/L甘油肉汤的胴体表面及加工用具拭子液体倒入225 mL营养肉汤中，用手顺时针摇匀样品液时间持续1 min～2 min，制成1∶10的样品匀液。密封锥形瓶放入36℃±1℃恒温箱，培养15 h。

1.2.3E.coli+S.en-μPADs检测 根据E.coli+S.en-μPADs使用步骤：取培养15 h后的样品处理液1 mL，加入到盛有5 mL营养肉汤的离心管中，置于37 ℃恒温摇床上，以190 r/min的转速，培养5 h。将富集5 h后的菌液直接滴加在E.coli+S.en-μPADs上，置于37℃温箱1.5 h，在加有沙门菌底物端滴加显色剂固蓝b盐，反应完成后，将试纸显色结果扫描，用ImageJ 1.4 u读取E.coli+S.en-μPADs的灰度值。结果判定结合试纸显色判定：若E.coli+S.en-μPADs的灰度值大于空白对照的灰度值，则表示检出沙门菌；若E.coli+S.en-μPADs的灰度值小于或等于每组空白对照，则表示未检出沙门菌。

1.2.4 绿洲食品沙门菌快速检测试纸检测 参照绿洲食品沙门菌快速检测试纸片使用说明书，将沙门菌测试片置于无菌操作台内，揭开覆盖薄膜，用无菌吸管或移液枪吸取1 mL的样品匀液于无纺布棉垫上。待液体完全被无纺布棉垫吸收后，盖上覆盖薄膜，保证测试片边缘不出现褶皱，盖上覆盖薄膜后轻轻按压测试片边缘，保证覆盖薄膜粘帖牢固。每个稀释度须接种2张测试片，同时做1片空白阴性对照。将加样后的测试片正置于37℃恒温培养箱培养15 h～24 h。培养后的测试片上沙门菌显紫红色，而其他菌群显蓝色。

1.2.5 符合率计算 阳性符合率=E.coli+S.en-μPADs检出阳性样品与绿洲食品沙门菌快速检测试纸检出阳性样品相符合数/绿洲食品沙门菌快速检测试纸检出阳性样品总数×100%

2 结果

2.1 农贸市场畜禽肉检测结果

E.coli+S.en-μPADs与绿洲食品沙门菌快速检测试纸具体检测结果如表1所示。E.coli+S.en-μPADs与绿洲食品沙门菌快速检测试纸在对农贸市场畜禽肉检测结果对比结果发现，检测畜禽肉样15份，E.coli+S.en-μPADs检出10份大肠埃希菌和11份沙门菌，绿洲食品沙门菌快速检测试纸检出9份沙门菌，E.coli+S.en-μPADs与绿洲食品沙门菌快速检测试纸二者的沙门菌阳性检出符合率为100%。

表1 农贸市场畜禽肉检测结果

注：“+”表示检出，“-”表示未检出。

Note："+" indicates that a strain was detected, "-" indicates that a strain was not detected.

2.2 农贸市场畜禽肉加工用具检测结果

E.coli+S.en-μPADs与绿洲食品沙门菌快速检测试纸具体检测结果如表2所示。E.coli+S.en-μPADs与绿洲食品沙门菌快速检测试纸在对农贸市场畜禽肉加工用具检测结果对比结果发现，检测25份农贸市场畜禽肉加工用具，E.coli+S.en-μPADs检出大肠埃希菌17份，沙门菌21份。绿洲食品沙门菌快速检测试纸检出沙门菌15份，二者沙门菌的阳性检出符合率为93.3%。

3 讨论

李小玲等建立的沙门菌内标聚合酶链反应(PCR)试剂盒，刘亚娟等[16]用夹心DNA杂交方法、王文彬等[17]发明金标试纸传感器等多种快检食品中沙门菌方法，主要研究方法依靠血清学试验方法或者分子生物学方法结合传统方法，需4 d～5 d才能得出完整的检测报告。除此之外，试验所需的血清学试验和分子生物学中相关实验仪器都集中在大城市中的实验室内，无法实现生产一线病原菌的即时检测。国内外科研工作者所研究的热门领域转向全自动生物分析检测系统，问世的有Vitek系统、Biolog系统、Soleris系统、焦磷酸测序技术等，具有实时性、准确性、样品量大等优势，但无法摆脱专业仪器和技术人员的依赖。因此，迫切需要“轻简技术”来实现快速“筛查”、“抽检”的需要，从而能实现沙门菌的有效和准确检测。

通过比较E.coli+S.en-μPADs与商品化的食品沙门菌快速检测试纸在畜禽肉生产一线应用效果显示，两种快检试纸均可初步检出食品中沙门菌的存在。从对样品检测周期上分析可知，商品化快检试纸无需经历样品前增菌培养，需15 h～24 h即可鉴定结果，E.coli+S.en-μPADs要求15 h初增菌，5 h增菌培养，1.5 h的显色培养，但样品的检测时间只有21.5 h，较商品化快检试纸缩短2.5 h。目前市售食品沙门菌快速检测试纸价格为9元/片～45元/片，而E.coli+S.en-μPADs价格约1元/片。在完成样品检测时，需在市售食品沙门菌快速检测试纸滴加液体1 mL，E.coli+S.en-μPADs仅需滴加液体90 μL，且显色结果稳定。

由于E.coli+S.en-μPADs与市售食品沙门菌快速检测试纸比较而言，在农贸市场畜禽肉检测中阳性符合率较高，达到100%，但在农贸市场畜禽肉加工用具阳性检测符合率为93.3%，其主要原因可能在于畜禽肉加工用具中含菌量低，E.coli+S.en-μPADs不能检测出，仍需要对E.coli+S.en-μPADs的灵敏度进一步研究改进。

表2 农贸市场畜禽肉加工用具检测结果

注：“+”表示检出，“-”表示未检出。

Note：“+” indicates that a strain was detected,“-” indicates that a strain was not detected.

与市售食品沙门菌快速检测试纸检测方法相比，E.coli+S.en-μPADs从增菌培养到报告结果时间短，节省样品液消耗，仅需90 μL待检样品液即可呈现肉眼可见的显色反应。但与食品沙门菌快速检测试纸相比，在检测灵敏度方面尚需进一步改进提高。