山西省低致病性禽流感病毒检测及基因分析

王红宝，李红丽，郭雪丽*，吉 涛，韩惠瑛

(1.山西省农科院畜牧兽医研究所，山西太原 030032; 2.山西省动物疫病预防控制中心,山西太原 030027)

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病[1-2]。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。低致病性禽流感虽然不会造成禽群的大规模死亡，但常常引起鸡群轻度的呼吸道感染或产蛋率下降。禽流感病毒还能破坏免疫系统造成鸡的免疫抑制，使鸡群极易继发其他疾病，导致体质下降、病死率上升，给养鸡业带来严重的经济损失[3-6]，目前，规模化养鸡场禽流感防疫效果还不尽如人意，虽然问题是多方面的，但疫苗毒株与地区流行毒株是否一致，是免疫成败的关键所在。本文在已有研究的基础上，选择山西省主要养鸡地区有代表性的和规模化养鸡场的疑似病例喉气管、脑、胸肌、心肌和肺组织等样品进行禽流感病毒检测，弄清当地的主要流行毒株，对禽流感防控有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病料样品采集 自2013年以来，在山西省运城市、临汾市、太原市、晋中市、忻州市、吕梁市、长治市、晋城市及大同市等养鸡业发展较好的地市，将现代网络系统与传统流调模式相结合，建立了山西省规模化养鸡场禽流感病毒监测网络平台，运用流行病学调查和实验室检测方法对养鸡场低致病性禽流感进行全方位的监测。采集病死或扑杀鸡的喉气管、脑、胸肌、心肌和肺组织等，活禽静脉采集血液、采集气管拭子或泄殖腔拭子，雏禽采集新鲜的粪便(要求送检的病料新鲜，严禁反复冻融)。各监测点鸡场共采集、处理、送检疑似样品608份，具体采样地区见表1。

1.1.2 SPF鸡胚和毒株 9日龄～11日龄SPF鸡胚，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供；H1、H3、H9亚型禽流感AIV标准毒株由中科院微生物研究所提供。

1.1.3 主要试剂 RNA酶抑制剂、LATaq、DNA Marker聚合酶等，TaKaRa公司产品；Simply P Total RNA Extraction Kit，BioFlux公司产品；AMV，Promega公司产品；琼脂糖凝胶等常规试剂均为分析纯级。

表1 疑似低致病性禽流感的病料来源分布区

1.2 方法

1.2.1 样品处理与培养 取采集的组织样品放入研磨器中磨碎，加入PBS制成10%～20%的悬液，采集的拭子浸入2 mL～3 mL的PBS中，充分振荡，反复挤压，弃去拭子，在不超过25℃的室温下1 000 r/min离心10 min～15 min，取上清液保存。全血样品处理，待血凝后取血清保存在灭菌的1.5 mL离心管中，待进行下一步试验。

将处理后的样品经0.22 μm滤器过滤除菌，经无菌检验为阴性后，接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，于37℃培养箱内孵育，孵育至96 h，期间，弃去24 h内死亡鸡胚。连续盲传3代～5代。收集尿囊液按常规方法做血凝试验(HA)，然后分别用抗NDV、抗H1亚型、抗H3亚型、抗H9亚型的AIV标准阳性血清做血凝抑制试验(HI)。将血凝效价≥7log2的样品进行编号，分装于1.5 mL离心管置-80℃保存，并进行下一步RNA提取。

1.2.2 禽流感病毒总RNA的提取 取尿囊液病毒100 μL，采用Simply P Total RNA Extraction Kit提取样品总RNA(按照说明书进行)。提取后立即用于反转录或置-80℃冻存备用。

1.2.3 反转录合成禽流感病毒cDNA 以总RNA为模板，Radom Primer为引物，在AMV的作用下合成第1链cDNA。反应体系为50 μL，在0.5 mL PCR反应管中，先加入总RNA 10 μL，Radom Primer(10 pmol/μL)2 μL， AMV(10U/μL)2 μL，5×buffer 6 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL，DEPC处理水5 μL。混合后，加灭菌石蜡油50 μL。反应条件为：25℃ 10 min，42℃ 90 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.2.4 PCR扩增鉴定禽流感病毒 按本课题组建立的H1、H3、H9亚型三联RT-PCR方法[7]进行。PCR反应的条件如下：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53℃ 50 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。取PCR产物5 μL，以DL 2 000为Marker，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察所扩增片段的大小，以鉴定所扩增样品是否是禽流感病毒。

根据GenBank登录的H1、H3、H9亚型禽流感病毒基因序列，经多序列比对，在保守区用 Premier5.0软件设计引物，TaKaRa公司合成，引物设计见表2。 PCR扩增鉴定禽流感病毒具体反应体系见表3。

表2 引物设计

表3 PCR扩增AIV反应体系

1.2.5 基因的克隆 将鉴定为阳性的样品，用通用引物扩增其全长序列。通用反转录引物序列5′-AGCAAAAGCAGG-3′。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析、回收纯化后，连接T载体在4℃条件下过夜，次日转化到E.coliDH5α感受态中，涂于含有Amp抗性的LB平板，挑取单菌落，于180 r/min摇床，37℃培养12 h后，提取质粒，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.2.6 基因序列分析 应用DNA Star7.1软件对测得的序列进行拼接，登录GenBank中下载的序列进行序列比对分析。

2 结果

2.1 病毒的RT-PCR检测结果

部分样本PCR鉴定电泳图见图1。

M.DNA标准DL 2 000；1.H1、H3、H9亚型AIV；2～10.待检样品

M.DNA Marker DL 2 000；1.H1，H3，H9 subtypes of AIV；2-10.Detected samples

图1三联RT-PCR法检测样品电泳图

Fig.1 Electrophoregram of samples detected by triplex RT-PCR

由图1可知，721 bp为H3亚型AIV出现的条带，487 bp为H9亚型AIV出现的条带，346 bp为H1亚型AIV出现的条带。9份待检样品，其中8份都出现了487 bp的条带，说明该样品毒株均含H9亚型禽流感AIV。重复该试验，对各监测点送检的疑似样品608份进行检测，检测结果发现，有68份禽流感病毒阳性，经RT-PCR检测，出现487 bp左右条带的有65份，即判定该65份为H9亚型，其余3份样品RT-PCR检测没条带出现，即判定该3份样品中不含H1、H3、H9亚型AIV。65份H9亚型发病地区分布情况及发病鸡日龄分布情况见表4和表5。

表4 65份低致病性禽流感的病料来源分布

表5 65份低致病性禽流感发病鸡日龄分布

由表4结果结合表1中病料采样数计算可得，各地区疑似鸡低致病性禽流感病料检出率在太原地区为5.26%、大同地区为8.82%、晋城地区为6.78%、临汾地区为13.04%、运城地区为12.50%、晋中地区为9.88%、长治地区为13.70%、忻州地区为11.59%、吕梁地区为13.25%。

由表5可知，鸡低致病性禽流感的发病日龄主要在110日龄以上，60日龄～110日龄鸡发病率较低，0～60日龄鸡很少发病。

2.2 全长血凝素(HA)基因RT-PCR扩增结果

对样品进行全长血凝素(HA)基因RT-PCR扩增，扩增出约为1 700 bp大小的特异性条带，其长度与预期相符合。扩增结果电泳图见图2。

2.3 血凝素(HA)基因序列分析结果

经测序获得样品H9亚型AIV的HA基因的cDNA全序列，总长度约为1 700 bp，包含了一个完整的开放读码框(ORF)。通过对血凝素(HA)基因的氨基酸序列分析，所测样品的HA切割位点的序列均为RSSR ↓ GLF(335-334位)，切割位点附近无连续性碱基插入，符合低致病性禽流感病毒的特征。

2.4 血凝素(HA)基因cDNA序列同源性比较结果

经对检测数据统计分析，各样品毒株间HA基因核苷酸序列同源性为96.5%～98.1%，其HA基因与我国现有疫苗的HA基因核苷酸及部分已分离鉴定毒株的序列同源性为88.9%～93.8%，说明HA基因已发生较大的遗传漂变(表6)。

M.DNA标准DL 2 000；1～4.H9亚型禽流感病毒

M.DNA Marker DL 2 000；1-4.H9 subtypes of AIV

图2 全长HA基因的PCR扩增电泳图

注：a连线(对角线)右上方为核苷酸序列同源性结果，左下方为核苷酸差异性结果。

Note：a line (diagonal) upper right is nucleotide sequence similarity result，the lower left is a nucleotide difference.

3 讨论

从以上结果分析可知，山西省规模养鸡场流行的低致病性禽流感病毒主要为H9亚型AIV，在山西省的9个地区都有发病，主要是110日龄以上的蛋鸡感染发病，雏鸡和青年鸡有零星出现。根据核苷酸序列同源性研究结果分析，山西主要流行的禽流感病病毒与目前市场上相关疫苗所用的毒株相比较，其HA基因已发生较大的遗传漂变。

根据研究结果分析，各地区病料采样疑似鸡低致病性禽流感病料检出率在5.26%～13.70%之间。检出率比较高的地区为长治、吕梁、临汾、运城等，这几个地区养鸡相对集中，规模化养殖场附近小型养殖户也比较多，造成低致病性禽流感的流行相对严重些；检出率比较低的地区主要有太原、晋城、大同等，与这几个地区养鸡场分布相对分散，养鸡场附近小型养殖户相对较少，鸡场管理相对严格有很大关系。疑似病料的检出率与病料采集人员的对鸡低致病性禽流感发病症状的认识水平也有着很大的关系。

本研究中初步分离鉴定出68份禽流感病毒，通过进一步鉴定其中65份为H9亚型AIV，另外3份样品毒株不属于H1、H3、H9亚型禽流感，究竟属于哪个亚型，有待今后研究。

本研究所采病料的养鸡场对低致病性禽流感的防疫(只免H9亚型)通常是在鸡45日龄～60日龄首免，100日龄～120日龄二免，300日龄～350日龄加强免疫。2008年，谢海燕等[8]报道了禽流感疫苗对采集活禽泄殖腔、喉拭子样品中禽流感病毒PCR检测结果的无影响。本研究采集的是疑似禽流感发病鸡的病料，对PCR检测发病病原的诊断结果应该没有明显影响，有待进一步研究证明。

依据禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，禽流感病毒有许多亚型。现已鉴定出HA亚型有15个(H1～H15)，NA亚型9个(N1～N9)。低致病性禽流感病毒主要是H1、H3、H9亚型，而H5、H7亚型具有高度的致病力。据报道，全球超过90%的H9N2病毒株来自亚洲，其中72%左右来自中国[9]。根据国内外研究发现人感染H7N9和H10N8禽流感病毒部分内部基因均来自H9亚型病毒[10]。由此可见，无论是高致病性禽流感病毒还是低致病性禽流感病毒，都对人们的健康和生命安全产生了危害。我国是世界上家禽养殖大国，禽流感的检测和防控已经成为不可忽视的民生问题[11-14]。H9N2亚型禽流感病毒在我国不但广泛存在，而且变异迅速，由最先出现和流行的BJ/94-like到G1-like、G9-like、Y439-like、Y280-like毒株，经历20年时间，目前我国H9N2亚型禽流感病毒至少存在75种基因型，且不断有新变异毒株和基因型的出现[15-17]。弄清山西低致病性禽流感的流行毒株情况，对当地禽流感的防控有十分重要的意义。