奶牛溶菌酶基因的构建、表达及活性研究

李云龙，高 峰，张海涛，顾开朗

(徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221006)

溶菌酶(Lysozyme，LYZ)全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能够特异水解细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1，4-糖苷键，是一种具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效应分子[1]。目前在高等反刍动物(如牛、羊和鹿等)基因组中存在大概10种溶菌酶相似基因[2]。反刍动物虽然有众多溶菌酶基因，但相对于其他动物机体缺乏溶菌酶[3]。此外，不同组织溶菌酶表达差异巨大，牛肾、血液、泪液、乳汁中溶菌酶表达水平低于大多数动物[4]，牛溶菌酶在乳腺中水平较低，仅为0.05～0.13 mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表达量可比其高2000～4000倍[5]。本研究选择原核大肠杆菌表达系统，对奶牛乳腺溶菌酶基因进行克隆表达，以期获得高效表达的奶牛溶菌酶载体，为奶牛溶菌酶的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

限制性内切酶NcoI、XhoI购自Fermentas公司，表达载体pET32T，T4 DNA Ligase，2×Taq Master Mix，PCR产物回收试剂盒，胶回收试剂盒，DL5 000 bp Marker，大肠杆菌TOP10菌株，中分子量蛋白Marker，6×His标签蛋白纯化试剂盒(Ni-IDA)，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自ProbeGene公司，寡核苷酸合成以及DNA测序服务由上海生工提供， SDS，异丙基硫代半乳糖苷-诱导剂(IPTG)购自Amersco公司，Acr、Bis、Tris购自Sigma公司，TEMED购自BIO-RAD公司，人溶菌酶标品购自Merck公司，其它常规试剂从国药集团采购。

1.2 试验方法

1.2.1 LYZ基因cDNA链的合成 根据已知的奶牛LYZ基因mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_001077829.1)，用Primer Premier 6.0软件将其翻译为cDNA序列，并由上海生工公司合成。序列为：CCATGGCTAAGAAATTTCAGCG TTGTGAGCTGGCGCGGACGCTGAAAA AGCTGGGGCTGGACGGCTACCGGGGCGTGAGTTT>AGCAAACTGGGTTTGTCTGGCACGTTGGGA GAGTAATTATAATACGAGAGCAACAAATT>ACAACCGTGGTGATAAAAGCACAGATTATG GTATTTTTCAGATCAATAGCCGTTGGTGGT GTAATGATGGGAAAACACCGAAAGCAGTGA ATGCATGTCGGATTCCGTGTAGCGCACTGCT GAAAGATGATATCACCCAGGCGGTTGCATG TGCGAAGCGCGTTGTGAGAGATCCCCAGGGG ATTAAAGCATGGGTTGCATGGCGTAACAAA TGTCAAAATAGAGACCTGAGAAGCTACGTG CAGGGGTGTCGGGTTTAACTCGAG。其中CC ATGG为引入的NcoI酶切位点、CTCGAG为引入的XhoI酶切位点。

1.2.2 酶切反应 采用双酶切获得目的片段，以下体系放入37 ℃恒温水浴锅中反应2 h后，胶回收获得载体片段和目标片段。pET32T载体采用NcoI、XhoI双酶切线性化后通过胶回收获得载体片段。酶切反应体系为：目的片段酶切体系50 μL：目的片段1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI1μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。载体的酶切体系50 μL：载体1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI 1 μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。

图1 pET32T克隆和表达区域T7启动子;乳糖操纵子;T7终止子;Trx标签;His标签;:T7终止子引物;凝血酶;肠激酶Fig.1 pET32T cloning and expression region T7 promoter;lac operator;T7 terminator;Trx·Tag;His·Tag;T7 terminator primer;thrombin;enterokinase

1.2.3 连接反应 将上述回收纯化好的目的DNA片段和载体片段，进行连接，按下述反应体系22℃在PCR仪中连接反应1 h。反应体系如下：载体片段4 μL，目的基因片段8 μL，10×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4 DNAligase 1 μL (400 u/μL)，加ddH2O至20 μL。

1.2.4 重组质粒的转化、筛选和鉴定 挑选单菌落生长后用T7通用引物PCR扩增筛选阳性克隆。T7通用引物：T7上游引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7下游引物5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30循环；72 ℃ 2 min，4 ℃保存。PCR产物琼脂糖凝胶检测并测序。挑选单菌落提取质粒，采用NcoI、XhoI双酶切验证条带大小，反应体系如下：载体1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI1 μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。37 ℃水浴锅中反应2 h。酶切产物用琼脂糖凝胶检测。

1.2.5 融合蛋白pET32T-LYZ 的表达和分析 挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基(含50 mg/L氨苄)37 ℃培养约4 h，OD600为0.6左右，加入终浓度为0.6 mM的IPTG诱导pET32T-LYZ的表达。37 ℃诱导两个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白样品进行13%SDS-PAGE电泳。

1.2.6 重组蛋白的纯化及浓度测定 把重组蛋白凝胶浸泡在0.25 mol/L的KCL溶液中10 min，将含有目的蛋白的凝胶切下放入透析袋中，并加入10 mL Tris-甘氨酸缓冲液，120 V电泳2 h，再反置透析袋继续电泳10 min，目的蛋白用pH 7.5的磷酸盐缓冲液放置在4 ℃冰箱中透析过夜，紫外分光光度计测定其浓度。

1.2.7 酶标仪快速比浊法测定LYZ活性 本试验参照苍金荣[6]建立的快速比浊法检测溶菌酶活性，用PBS将人溶菌酶标准品配成活力为5 000、4 000、3 000、2 000、1 000 U/mL的标准液；以阴性菌株表达上清为对照，将不同浓度标准液和阳性菌株表达上清各取100 μL加入到酶标板中，迅速加入100 μL溶壁微球菌的菌悬液，37 ℃恒温作用5 min后测其吸光度A490。以标准液活性为纵坐标，吸光度A490平均值为横坐标绘制标准曲线y=ax+b，样品吸光度平均值代入方程得出样品的活性。

2 结果与分析

2.1 PCR筛选阳性克隆鉴定结果

随机挑选单菌落用pET32T载体的T7通用引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在1 000 bp位置处出现明亮条带(图2)，与预期产物大小一致，表明克隆结果为阳性。提取3号质粒进行测序验证，测序结果见图3，与目的片段的序列完全一致。

2.2 重组阳性克隆酶切验证

挑选单个菌落并提取质粒，用NcoI、XhoI双酶切验证条带大小，如图4。得到与理论值400 bp相符的条带，说明LYZ基因已成功克隆至pET32T载体中。

2.3 表达产物的鉴定及浓度测定

SDS-PAGE电泳图片显示(图5)，在IPTG诱导后，出现一条约为33 kD的蛋白条带，与理论分子量相当，表明LYZ蛋白表达成功。用紫外分光光度计检测切胶纯化后的重组蛋白质，其浓度为223 mg/L。

2.4 溶菌酶活性分析

溶菌酶活性与吸光度A490的线性回归方程为Y=6437.5-6899.5×A490，进行多次重复性检测，测得的A490值为0.623±0.00024，将其带入方程得到溶菌酶溶液的活性为2 139 U/mL。LYZ活性标准曲线见图6。

图2 LYZ-pET32T菌落PCR鉴定 M：DL5000bp DNA Marker；1-6：不同的克隆Fig.2 Analysis of bacterial colony of LYZ-pET32T by PCR

图3 LYZ-pET32T菌落测序结果Fig.3 Sequencing results of bacterial colony of LYZ-pET32T

图4 LYZ-pET32T限制性酶切验证结果 M：DL5000bp DNA Marke；1：酶切前质粒；2：双酶切质粒Fig.4 The result of restriction enzyme digestion of LYZ-pET32T M：DL5000bp DNA Marke；1：Plasmid before digestion ； 2：Plasimd of double digestion

图5 表达及纯化产物的SDS-PAGE分析 1.未诱导；2.菌株1诱导后；3.菌株2诱导后； M.中分子量蛋白MarkerFig.5 SDS-PAGE profile of expressed and purified LYZ 1. non-induced;2. strain 1 after induced; 3. strain 2 after induced;M. Marker of moderate

3 讨 论

溶菌酶作为哺乳动物机体防御因子的重要成员，在食品、工业和医学中有巨大的应用。在饲料生产与家畜饲养中，配合其他添加剂可以延长饲料的贮存期，同时又可以预防和治疗动物消化道腹泻等疾病。邢思华等[7]在基础饲料中添加溶菌酶制品饲喂草鱼,对草鱼生长性能和抗感染能力有显著影响。在兽医临床方面，可以用于预防和治疗奶牛的乳房炎、阴道炎、皮肤溃疡、急慢性子宫内膜炎等细菌感染性疾病。很多学者尝试将具有较高活性的人溶菌酶基因转入到奶牛[8]和奶山羊[9]，使牛、羊乳腺分泌表达人溶菌酶，从而提高对乳房炎的抵抗力。杨睿等[10]用不同来源的四种溶菌酶对引起奶牛乳房炎的葡萄球菌做抑菌试验，并从中筛选出抑菌效果最好的样品。沈诚等[11]构建人的溶菌酶基因表达载体，将其注入患有乳房炎的奶牛的乳腺组织，其治愈率(97.4%)显著高于传统药物组(69.2%)。本试验将奶牛溶菌酶作为一种新型的内源性药物通过饲喂和注射来预防和治疗奶牛乳房炎，不仅能够有效遏制滥用抗生素导致的一系列问题，而且不会对人产生免疫原性，对于动物抗病育种意义重大。本试验所获得的重组奶牛溶菌酶其本质属于转基因产品，长期使用这类药物的安全性问题还需进一步评估。

溶菌酶在真核系统和原核系统中表达的报道有很多，齐长学[12]构建酵母分泌型表达载体pPICZαA-LYZ1，并在受体菌BL21(DE3)和GS115中成功表达，章欢[13]将牛溶菌酶基因已克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，并转化大肠杆菌BL21，同样获得了良好的表达效果，有学者认为溶菌酶对大肠杆菌有较强的杀菌作用，对宿主菌有一定毒性，致使溶菌酶在大肠杆菌中无法直接表达。从本试验的结果看，表达的蛋白以无活性的包涵体形式存在，很好地避免了上述问题，后续可以利用简单的超声裂解和离心方法即可获得纯化的重组蛋白，便于后期研究重组蛋白质的生物学活性。

本研究在获得目的基因CDS序列时，采用的是人工设计并合成的方法，这与付世新等[14]所采用的方法一致，而王洪亮[15]在获得LYZ基因CDS序列时，采用了RT-PCR的方法，结果某些亚型溶菌酶基因由于表达量很低没有克隆成功。本试验决定采用人工合成的方法获得目的基因片段，主要原因有三点：第一，目的片段碱基含量较少，用合成的方法可以大大降低成本；第二，合成的片段是高保真的，不会因为采样时个人的差异造成碱基的突变；第三，可以在合成的片段上加以修饰，增加一些酶切位点，方便后续的连接反应。

4 结 论

本研究成功构建原核表达载体LYZ-pET32T，通过诱导获得了高效表达的奶牛溶菌酶蛋白，并检测了活性，为奶牛溶菌酶的应用奠定了基础。