鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达

吕慧娇，康路路，张 萌，闫娜娜，张经纬，高文昌，徐坤，张智英

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)是主要危害鲤科鱼类，能够引发感染鲤春病毒血症(SVC)的一种弹状病毒[1]，是影响鲤科鱼生产养殖业经济效益的主要病毒之一。感染SVCV的鱼体会出现腹部膨大、皮肤和鳃部出现血色斑点等症状[2]。SVC已被世界动物卫生组织(Office international des épizooties，OIE)列为必须申报的疾病之一，也被中国农业部列为《中华人民共和国进境动物》二类动物疫病，是鱼类口岸检疫的主要对象之一[3-4]。SVCV最早由Fijian等[5]研究分离出来，属弹状病毒科、水泡性病毒属的单股负链RNA病毒[6-7]。2003年，有人首次在国内分离出SVC可疑毒株，并用特异性引物扩增出了阳性片段[8]。自2001年，SVCV(VR-1390)的第一个全基因组核苷酸序列被揭示后，GenBank中共有5个SVCV的全基因组序列[9]。SVCV基因组序列全长约为11 kb[10]，含有5个主要的开放阅读框(ORFs)，分别编码物种蛋白，分别为：核蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(polymerase，L)，其ORFs的排列次序为3'-N-P-M-G-L-5'[11]。其中，糖蛋白(G)位于SVCV囊膜表面，是最主要的表面抗原，能够诱导引起鱼体产生中和抗体，参与病毒的感染[12]、免疫识别[13]、和介导病毒的内吞作用[14]等，可作为SVCV免疫诊断的抗原，同时也是抗病毒药物的理想靶点。因此，针对糖蛋白基因序列与功能的研究对于揭示SVCV的免疫原性以及研制针对性的疫苗具有重要意义。研究表明，可通过pET-32a载体对目标蛋白进行原核诱导[15-16]，但G蛋白的表达量很低。本研究将截短后以及密码子优化后的G蛋白序列分段插入原核表达载体pET-32a中，旨在对SVCV糖蛋白序列进行原核诱导优化及免疫原性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体及试剂 大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α与E.coliBL21(DE3)以及原核表达载体pET-32a均由本实验室保存。pEGFP-G质粒由西北农林科技大学动物水产病害试验室馈赠。

1.1.2 试剂 dNTPs、Easy-Taq聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；琼脂糖、IPTGDNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自Omega公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Thermo公司；考马斯亮蓝购自上海双螺旋生物科技有限公司，DNA maker与蛋白质marker购自北京全式金生物(TansGen Biotech)公司；抗鲤鱼IgM单克隆抗体(Aquatic Diagnostics-Common/Koi carp IgM antibody-HRP conjugate)购自广州威佳科技有限公司

1.1.3 密码子优化的G序列合成 由于表达载体为细菌，据此对G基因片段进行密码子优化，在金唯智(GENEWIZ)公司进行基因片段合成，并在两端设计引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 SVCV-G基因及截短后基因片段的克隆 以pEGFP-G质粒测序结果为模板，用Primer Premier 5.0软件分别进行引物设计，目的即获得pEGFP-G质粒中G基因全长序列及其截短后的基因片段。其中，G的上下游引物分别命名为G0F、G0R，截短后G片段的四对引物分别命名为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R(表1，其中划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点识别序列)。

表1 试验所需引物Table 1 Primers that needed in the experiment

根据表1中的引物进行PCR扩增，反应体系为：pEGFP-G质粒1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，dNTPs 3.2 μL，10×Easy Taq Buffer(10×) 4 μL，Easy Taq聚合酶0.8 μL，Easy Pfu聚合酶0.3 μL，ddH2O 30.8 μL。PCR扩增反应参数如下：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存10 min。对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒分别对5种目的条带(G0, G1, G2, G3, G4)回收，置于-20℃保存备用。

1.2.2 表达载体pET-32a-GX的构建与鉴定 将1.2.1中的5种PCR产物与pET-32a载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行双酶切，回收目的片段后，将5种PCR产物分别与酶切后的pET-32a片段用T4连接酶于16 ℃连接10 h。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α，涂布于含0.1 mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基，于37 ℃培养箱中培养12 h，分别挑取阳性克隆菌株，提取质粒进行PCR验证和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，将验证正确的菌株送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序鉴定。将含SVCV G基因原序列的重组表达质粒命名为pET-32a-G0；根据截短序列5'-3'的顺序，将截短后的重组表达质粒分别命名为pET-32a-G1，pET-32a-G2，pET-32a-G3，pET-32a-G4(图1)。

图1 pET-32a-GX载体的构建Fig.1 Construction of the expression vector pET-32a-GX

1.2.3 表达载体pET-32a-Optimized G的构建与鉴定 将含有密码子优化后G基因的片段与pET-32a载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行双酶切，回收目的片段后，T4连接酶于16 ℃连接10 h。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α，涂布于含0.1 mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基，于37 ℃培养箱中培养12 h，分别挑取阳性克隆菌株，提取质粒进行PCR验证和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切验证，将验证正确的菌株送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序鉴定(图2)。

1.2.4 重组表达载体的诱导表达 分别将鉴定正确的重组质粒pET-32a-GX与pET-32a-OG转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，涂布于含0.1 mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基，于37 ℃培养箱中培养12 h，随机挑取单克隆扩大培养，将菌液送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序鉴定。

经过初步诱导条件预试验后，确定最佳优化条件。将空载体pET-32a以及测序正确的阳性克隆菌过夜培养至一定浓度后，按体积比1：50接种于含0.1 mg/mL氨苄青霉素(Amp)的10 mL LB液体培养基，37 ℃摇床培养至OD600为0.5～0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2 mmol/L，诱导3～4 h，收集菌液，将菌液于8 000 g/min离心5 min，弃上清后将沉淀用300 μL冰上预冷的PBS与7.5 μL PMSF重悬。于冰上用超声波破碎仪处理样品至澄清，12000 g/min 离心1 min，分离保存上清，将沉淀再次用300 μL冰上预冷的PBS与7.5 μL PMSF重悬后后保存样品。

图2 pET-32a-OG载体的构建Fig.2 Construction of the expression vector pET-32a-OG

1.2.5 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 根据所表达蛋白的大小，配制 12 %分离胶和5 %浓缩胶。将1.2.4中获得的上清液和重悬后的沉淀分别取30 μL，各加入6 μL SDS蛋白上样缓冲液(6×)混合均匀后放于沸水浴中煮沸5 min，室温冷却后取20 μL进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色6 h，再加入脱色液放置于摇床上进行脱色4 h，期间多次更换脱色液，只蛋白条带清晰可见后拍照保存。

1.2.6 诱导蛋白的Western blotting检测 诱导蛋白进行SDS-PAGE检测后，将目的蛋白片段转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜并放置于含封闭液的平皿中，室温脱色摇床封闭1 h；用含体积分数为0.1 % Tween-20的PBST溶液清洗3次×10 min，加入经TBST稀释的一抗，室温孵育4 h后，同样用PBST溶液清洗3次×10 min后，加入抗鲤鱼IgG-HRP，室温孵育2 h；用PBST溶液清洗3次×10 min后进行曝光步骤并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 SVCV-G基因及截短后基因片段的克隆

通过PCR从pEGFP-G质粒中获得长度为1092 bp的G0片段(图3)与长度分别为326 bp、315 bp、300 bp、303 bp的阶段后的G1、G2、G3、G4片段(图4)，采用BLAST将测序结果与模板序列对比后且检测结果与预期结果一致。

2.2 表达载体pET-32a-GX的构建与鉴定

将纯化后的PCR产物分别插入pET-32a载体中，并将重组质粒进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，检测结果显示与预期基本一致(图5)，采用BLAST将测序结果与模板序列对比后显示插入序列与预期相同，证明成功构建了5种表达载体pET-32a-GX。

2.3 表达载体pET-32a-OG的构建与鉴定

将含有密码子优化后G基因插入pET-32a载体中，并将重组质粒进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，检测结果与预期片段大小一致，测序结果也显示插入序列与预期相同，证明成功构建了表达载体pET-32a-OG(图6)。

图3 扩增产物G0的电泳图谱 M. DNA分子质量标准；1. PCR扩增产物Fig.3 Electrophoregram of amplified product G0 M. DNA Maker；1. PCR product

图4 扩增产物G1、G2、G3、G4的电泳图谱 M. DNA分子质量标准；1-4. PCR扩增产物Fig.4 Electrophoregram of amplified product G1, G2, G3 and G4 M. DNA Maker；1-4. PCR product

2.4 重组表达载体的诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检测

G蛋白的理论大小约为57 KD，且主要存在于沉淀包涵体中，重组表达菌株所表达的为截短后的G片段，经IPTG诱导后，结果表明，pET-32a-G3获得的蛋白量最多，pET-32a-G2次之，而pET-32a-G1、pET-32a-G4、pET-32a-G0与pET-32a-OG诱导结果不明显(图7)。

图5 重组表达载体pET-32a-GX的酶切产物电泳图谱 M. DNA分子质量标准；1-5. 重组表达载体 pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3、pET-32a-G4、pET-32a-G0的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切片段 Fig.5 Enzyme-digested product of recombinant expression vector pET-32a-GX M. DNA Maker；1-5. Plasmid pET-32a-G1, >pET-32a-G2, pET-32a-G3, pET-32a-G4, pET-32a-G0 digested by BamH Ⅰ and Xho Ⅰ

图7 重组蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE检测87083589 87088708 M. Blue Plus ⅠⅠ 蛋白Marker；1-7. 原核表达载体pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3 、pET-32a-G4、pET-32a-OG、pET-32a-G0和pET-32a所表达的重组蛋白样品；8. E. coli BL21(DE3) 空白菌株所诱导产物样品Fig.7 SDS-PAGE result of expression of induced protein in E. coli BL21(DE3) M. Blue Plus ⅠⅠ Maker; 1-7. Recombinant protein of plasmid pET-32a-G1, pET-32a-G2, pET-32a-G3, pET-32a-G4, pET-32a-OG, pET-32a-G0 and pET-32a; 8. Sample of the products induced by blank strain of E. coli BL21(DE3)

2.5 诱导蛋白的Western blotting检测

以本试验的诱导蛋白为抗原，以试验室已存鲤鱼血清为阳性血清作为一抗，以购买的抗鲤鱼IgM单克隆抗体作为二抗。通过Western blotting 检测，表明截短表达的重组蛋白更容易表达(图8)，且间接证明，截短表答的G与病毒的天然糖蛋白在免疫原性上的一致性。

图8重组蛋白诱导表达产物的Western blotting检测1-4. 原核表达载体pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3 、pET-32a-G4所表达的重组蛋白样品
Fig.8 Western blotting result of expression of induced protein in E. coli BL21(DE3) 1-4. Recombinant protein of plasmid pET-32a-G1, pET-32a-G2,pET-32a-G3 and pET-32a-G4 inE.coliBL21(DE3), respectively

3 讨 论

SVCV是严重影响世界多国渔业的主要病毒之一，给各国的鲤鱼养殖业造成巨大损失。2001-2004年，我国也曾开展了SVCV的监测工作，共分离鉴定了15个SVCV毒株，之后也陆续报道多篇有关SVCV的鉴定报道[17]。对于SVCV的检测方法也逐渐被开发，目前主要有间接免疫酶联免疫吸附试验(ELISA)[18]、间接免疫荧光试验(IFA)、套式RT-PCR[19]、荧光定量RT-PCR[20]、RT-LAMP[3]，SVCV糖蛋白是该病毒最主要的抗原，决定了病毒的血清学特征。SVCV工程菌表达的重组蛋白与SVCV毒株具有相同的免疫原性，但因SVCV完整的糖蛋白基因很难在体外获得大量高效表达，因此可通过截短方式获得重组载体进行诱导表达[17,21-22]。张家林等[22]将位于N端和C端的影响重组蛋白表达的部分疏水性氨基酸序列去除，采用糖蛋白的21～463 aa区段部分插入pET-28a质粒中进行原核诱导表达，并以体外诱导的蛋白作为免疫原制备了单克隆抗体。徐进等[17]通过软件对SVCV糖蛋白基因的亲水性及抗原表位进行分析后，将糖蛋白的29～467aa区段部分插入pGEX原核表达载体实现体外诱导表达，且重组蛋白的免疫原性较好。通过体外诱导的原核蛋白能够作为抗原为今后SVCV的免疫学诊断及相应疫苗制备的研究奠定基础，该试验也为今后的蛋白诱导工作提供了借鉴。

在进行体外诱导的预试验时，含有全长G蛋白基因的重组表达质粒在大肠杆菌中表达量很低，可能的原因是全长G含有较多的疏水性氨基酸及大肠杆菌中的稀有密码子等影响了蛋白的表达。因此，本试验针对两种潜在影响因素，通过分别设计不同引物扩增截短片段以及进行密码子优化两种方式进行再次诱导，实现了G蛋白的高效表达。结果表明，在相同诱导条件下，重组表达载体pET-32a-G3与pET-32a-G2的表达量显著高于其他重组载体，且免疫原性基本与pET-32a-G一致。该研究通过对SVCV糖蛋白基因的截短表达，证明截短后的基因片段仍能够表达重组蛋白，且免疫原性较好，该研究为今后体外进行的原核诱导表达蛋白提供参考。