神经生长因子受体p75NTR在喉癌Hep2细胞系中的表达

申宇鹏 李晓明 靳海峰 路秀英

摘 要：目的 初步探索神经生长因子受体在喉癌Hep2细胞系的表达情况并研究相关的细胞生物学特性。方法 应用免疫细胞化学及免疫荧光染色法，检测p75NTR在喉癌Hep2细胞系中的表达；应用流式细胞仪检测人喉癌Hep2细胞系中呈p75NTR高表达及CD133高表达细胞的分布比例情况。结果 喉癌Hep2细胞系内小部分肿瘤细胞显示免疫染色强阳性，p75NTR强阳性显色的细胞部分处于旺盛的增殖分裂状态；大部分呈CD133强阳性的Hep2细胞也呈p75NTR强阳性。结论 p75NTR高表达于喉癌Hep2细胞系中具有较强增殖活力的细胞，p75NTR信号通路对支持或促进喉癌细胞增殖具有潜在作用。p75NTR高表达的喉癌Hep2细胞与肿瘤干细胞之间的关系密切，有待进一步深入研究。

关键词：神经生长因子受体；喉癌；Hep2细胞系；免疫细胞化学

中图分类号：R739.65 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.016

文章编号：1006-1959（2018）15-0047-05

Expression of Nerve Growth Factor Receptor p75NTR in Hep2 Cell Line of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma

SHEN Yu-peng1，LI Xiao-ming1，JIN Hai-feng2，LU Xiu-ying1

（Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery1，Department of Digestive Medicine2，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050081，Hebei，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of nerve growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cell line and to study the related cellular biological characteristics.Methods Immunocytochemistry and immunofluorescence staining were used to detect the expression of p75NTR in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma，and the distribution of p75NTR and CD133 in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma was detected by flow cytometry.Results A small number of tumor cells in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma showed strong immunostaining，and the cells with strong positive coloration of p75NTR were in a proliferative and dividing state；most of the Hep2 cells positive for CD133 were also strongly positive for p75NTR.Conclusion p75NTR is highly expressed in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma and has strong proliferative activity.The p75NTR signaling pathway has a potential role in supporting or promoting the proliferation of laryngeal squamous cell carcinoma cells.The relationship between p75NTR-expressing laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cells and tumor stem cells is closely related and needs further study.

Key words：Nerve growth factor receptor；Laryngeal squamous cell carcinoma；Cell line Hep2；Immunocytochemistry

喉癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是头颈外科临床常见恶性肿瘤，喉癌通常可以损害患者的发音、呼吸、吞咽等功能，同时又具有破坏力强、易复发、易转移等特点，临床上很多患者难以治愈甚至危及生命。研究喉癌发病及恶性进展的相关机制，有助于探索治愈喉癌的有效途径。近年来肿瘤干细胞理论逐渐成熟，众多学者认为肿瘤组织内部包含少量拥有自我更新能力、分化能力及放化疗抵抗能力的特殊细胞群，与肿瘤的治疗后复发密切相关[1]。神经生长因子受体p75NTR（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成员之一，广泛分布于人体各组织系统及肿瘤细胞中[2]。除中枢及外周神经系统外，p75NTR蛋白也广泛地表达于上皮、间叶及淋巴造血组织等非神经组织系统。研究证实p75NTR在不同组织细胞类型、不同病理生理环境中执行的功能具有多样性，能够调节细胞的存活、增殖、分化、凋亡及创伤修复等效应[3]。近年来p75NTR在肿瘤细胞中的存在及作用引起广泛关注，目前国内外关于p75NTR在喉癌细胞系中的表达及功能文献少有报道，我们采用免疫细胞化学及流式细胞仪等方法研究p75NTR在喉癌Hep2細胞系中的表达规律和潜在作用，为进一步研究喉癌的综合治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1 Hep2细胞 人喉癌Hep2细胞系来自美国国家癌症研究所病理实验室，由白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科实验室传代培养。冻存Hep2细胞于37 ℃快速解冻，1000 rpm离心 5 min，用RPMI 1640培养基清洗1次，重悬后再离心，使用全培养基，设置为37 ℃培养于5%CO2的湿度培养箱中。

1.2主要抗体及试剂盒 免疫细胞化学试剂盒（SP-9002）系北京中杉金桥生物技术公司产品；磁珠分选试剂盒购自德国美天旎公司，p75NTR兔抗人单克隆抗体（ab52987）购自Abcam公司；CD133（18470-1-AP，proteintech）；HRP-山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术公司）；CY3标记兔二抗（protech）；Hoechst（碧云天）。

1.3仪器设备 荧光显微镜（DMIRB，德国Leica）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson FAC公司）；Hera CO2培养箱（德国GMBH公司）。

1.4免疫细胞化学及免疫荧光染色 将清洁消毒的20 mm盖玻片置于六孔板培养皿中，以5×104/ml的密度在六孔板中接种细胞并爬片，48 h后行免疫细胞化学及免疫荧光染色。贴壁均匀的Hep2细胞爬片经4%多聚甲醛PB固定10 min，0.2%Triton X-100（含0.1%BSA）孵育10 min。免疫化学染色采用常规SP法。铺片经3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶活性；滴加封闭用山羊血清，室温孵育20min，消除非特异性显色后，滴加一抗（p75NTR单克隆抗体稀释度1∶50），4 ℃孵育过夜；阴性对照组采用PBS抗体稀释液代替一抗；生物素标记二抗及辣根酶标记链霉素卵白素分别孵育20 min；使用新鲜配制的DAB显色2 min，苏木精复染，常规脱水、透明及中性树胶封片，显微镜下观察。

将前面制备的96孔板中的阳性细胞和阴性细胞分别进行p75NTR和CD133免疫荧光检测。细胞经4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；采用5%胎牛血清室温下封闭1 h；添加一抗（P75NTR：1∶400；CD133：1∶100）4 ℃孵育过夜；PBS洗清洗后加二抗，37 ℃孵育1 h；室温避光孵育Hoechst 15 min，荧光显微镜下拍照。

1.5喉癌Hep2细胞行p75NTR/CD133流式细胞仪检测

1.5.1常规培养条件下Hep2细胞p75NTR阳性率检测 喉癌Hep2细胞系培养在含有5%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，传代次数<30次。制备活性高的细胞悬液，用含5%FCS的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×107/ml，取200 μl细胞悬液（数量约2×106细胞）加入含2%BSA的PBS，4 ℃封闭30 min，用洗涤液洗涤1次，加洗涤液2 ml左右1000 rpm×5 min弃上清。抗体终浓度标准为：p75NTR（FITC）1 μg/L×106细胞（1∶10），阴性对照采用小鼠IgG1同型对照（FITC）1∶10。混合充分后4 ℃ 30 min；用洗涤液洗涤2次，立即上流式细胞仪检测。

1.5.2常规培养的Hep2细胞行p75NTR/CD133双标记检测 检测步骤与前类似，同时加入p75NTR（FITC 1∶10）及CD133（PE 1∶11）两种荧光直标抗体，共同避光孵育4 ℃ 30 min，洗涤2次后上流式细胞仪检测，参考同型对照来调节电压补偿。检测p75NTR/CD133双阳性细胞占总体细胞数的百分比。

2结果

2.1 p75NTR在喉癌Hep2细胞系中的表达情况 我们采用p75NTR单克隆抗体对喉癌Hep2细胞系行免疫细胞化学染色及免疫荧光染色发现相同结果：一小部分Hep2细胞呈p75NTR免疫反应强阳性（计数约4%～6%），见图1，免疫着色主要位于胞浆及胞膜。镜下可见部分p75NTR强阳性细胞正处于细胞分裂状态，也观察到正处在DNA合成期、细胞分裂期及分裂后期的細胞也呈p75NTR强阳性染色。镜下计数约30%～40%的细胞呈p75NTR免疫反应弱阳性，该部分细胞很少处于分裂期。此外，我们观察到也有一些镜下形态规则、外观为圆形及梭型的细胞呈p75NTR强阳性，这些细胞生长状态良好，并非凋亡的无结构残体，我们推测这部分细胞可能与肿瘤干细胞群比较接近。将Hep2细胞行p75NTR免疫荧光染色（CY3），采用Hoechst做核标记，也观察到上述类似结果。通过免疫细胞化学及免疫荧光染色我们确定p75NTR蛋白表达和喉癌Hep2细胞分裂增殖密切相关。

2.2喉癌Hep2细胞行p75NTR/CD133流式细胞仪检测 为进一步分析喉癌Hep2细胞系中p75NTR强阳性表达细胞的特点，我们进行了流式细胞仪检测。发现正常培养条件下，使用鼠IgG1同型对照FITC抗体，人喉癌Hep2细胞系中呈p75NTR强阳性的细胞比例为3.7%～6.2%左右。使用CD133抗体与p75NTR做双标记检测，双向十字门流式散点图可见，CD133强阳性细胞比率约0.7%，p75NTR及CD133双标阳性细胞比率仅为0.5%。其中大部分CD133强阳性细胞也呈p75NTR强阳性。见图2，图3。

3讨论

近年来针对头颈部鳞状细胞癌临床治疗中的易转移、易复发、放化疗耐受等特性和内在作用机制成为头颈肿瘤科学研究的热点。肿瘤组织在机体内的发病及生长都处在体液内环境中，受到人体微环境中众多生长因子及相关受体通路的调节及支持。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经营养因子家族重要成员，在神经系统细胞的发育和再生过程中有重要作用[4]，NGF拥有低亲和力的p75受体（p75NTR）和高亲和力酪氨酸激酶受体（Trks），NGF与受体p75NTR和TrkA之间相互作用非常紧密，调控机理很复杂。p75NTR属于细胞Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有三个结构域：富含半胱氨酸的膜外区、一次性跨膜区、连接下游信号途径的胞内区，共399个氨基酸组成。胚胎发育的早期，三个胚层的细胞均有p75NTR表达，发育成熟后部分组织内的表达下降或消失，在神经系统、上皮系统组织细胞内，发育成熟后仍有p75NTR表达。现有文献支持，NGF及其受体在上皮来源恶性肿瘤的生长过程中有重要作用[5]。以往关于p75NTR的研究大多针对神经系统，在肿瘤细胞中的报道很少。我们前期通过免疫组织化学形态学研究已经证实，p75NTR在喉癌组织内存在阳性染色，目前p75NTR在喉癌细胞系中表达情况尚缺乏研究证实。

近年来有关p75NTR受体在肿瘤生长、进展、转移中的作用引起国内外学者关注。越来越多的研究表明p75NTR在肿瘤的发生、转移、治疗耐药中发挥了重要的作用，现有文献证实，不同组织类型肿瘤中p75NTR执行的功能具有多样性。Jin HF在胃癌的研究中证实p75NTR表达明显降低或缺失，其表达水平与胃癌的分化程度负相关，稳定转染p75NTR表达质粒可以明显抑制胃癌细胞的增殖[5]。在膀胱癌及前列腺癌中p75NTR存在类似的抑癌作用[6]，学者们推测p75NTR抑制肿瘤的调节机制可能与其诱导凋亡的信号通路激活有关。与之相反，p75NTR在上皮细胞、食道、舌、口腔黏膜上皮等细胞中拥有明确的促增殖效应，这种效应也存在于这些组织起源的肿瘤细胞中。文献报道神经营养因子通过其受体p75NTR及Trk刺激黑色素瘤细胞增殖和转移，转染p75NTRsiRNA能抑制黑色素瘤细胞迁移[7]。有文献报道，食道鳞癌细胞系中p75NTR表达对细胞的存活和增殖具有支持作用，另有研究证实p75NTR结合其功能性配体NGF后，能通过激活NF-κB通路抑制乳腺癌细胞凋亡[8]。Soland经过口腔鳞癌的形态学研究发现，p75NTR表达和分布区域特性的改变能够判断患者治疗后复发或预后不良[9]。至今p75NTR在头颈肿瘤细胞中的调控机制尚未明确，与头颈肿瘤组织细胞类型、分化程度、局部微环境等相关。

我们前期形态学研究发现，在喉鳞癌组织中TrkA及p75NTR的阳性染色呈现特征性分布[10]，p75NTR表达多位于粘膜基底层及肿瘤生发层，位于增殖活力旺盛的区域。通过免疫细胞化学及免疫荧光染色的方法，我们证实：人喉癌Hep-2细胞系中小部分Hep2细胞呈p75NTR强阳性。我们也观察到，许多处在DNA合成期、细胞分裂期及分裂后期的Hep2细胞呈p75NTR免疫染色强阳性，这提示我们p75NTR表达与肿瘤细胞的增殖分裂密切相关。干细胞学说认为肿瘤干细胞（CSC）是肿瘤组织中具有自我更新、分化及增殖能力的特殊细胞。干细胞可以产生快速增生祖细胞群，针对干细胞及耐药细胞的相关研究是目前肿瘤基础研究热点。寻找特异性的肿瘤干细胞标志物，对肿瘤干细胞进行靶基因干扰或分子靶向治疗是众多学者探索的方向。我们发现p75NTR高表达于Hep2细胞中的未成熟细胞和具有强分裂增殖能力的细胞，故喉鳞癌中的p75NTR阳性细胞可能包含有快速增生祖细胞群或干细胞群，p75NTR在终末分化的细胞中呈低表达，这与喉癌组织的相应染色结果相符合，同时也与国外舌鳞癌细胞系的研究结果相近[11]。我们研究发现，p75NTR对喉癌细胞生长和增殖具有促进支持的作用，p75NTR这种作用的发挥可能与喉癌中同时表达NGF及TrkA有关。Okumura等在食道鳞癌中有类似的研究结果，他们发现转染p75NTR siRNA后引起食道鳞癌细胞系的增殖抑制和凋亡上升，认为p75NTR对食道鳞癌细胞的生长有支持作用，深入研究发现p75NTR阳性细胞与静止期食道鳞癌干细胞比较接近[12]。

通过流式细胞仪检测，我们发现喉癌Hep2细胞系中呈p75NTR强阳性的细胞比例仅为3.7%～6.2%左右。目前认为肿瘤CSC仅占肿瘤细胞的很小部分，却是肿瘤起源、放化疗后复发及转移的根源[13]。研究肿瘤干细胞的特性，需要特异性的表面标记将其从其它细胞中分离出来。目前国内外相对公认CD133是头颈部鳞癌肿瘤干细胞的标记物[14]，因此我们使用CD133抗体与p75NTR做流式双标记检测。双向流式散点图可见，p75NTR及CD133双标阳性细胞比率仅为0.5%。其中大部分CD133强阳性细胞也呈p75NTR强阳性。因此，我们推测p75NTR强阳性Hep2细胞中包含有肿瘤干细胞及快速增生祖细胞群。免疫染色结果提示p75NTR蛋白表达的上调和细胞分裂增殖密切相關，是伴随细胞增殖而上调p75NTR表达水平，还是p75NTR阳性细胞自身拥有强增殖活性，有待我们深入研究证实。p75NTR既能通过胞内死亡结构域等途径激活凋亡通路，也能通过激活NFκB促进生存，充分说明其对细胞生存、分裂及凋亡的精确调控[15]。目前在喉癌组织细胞中，p75NTR依赖的促生存机制尚未阐明，我们推测p75NTR与喉癌细胞的增殖、分化、耐药密切相关，探索如何通过p75NTR识别并杀伤喉癌肿瘤干细胞及耐药细胞，为喉癌的综合治疗提供新的方向。

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收稿日期：2018-7-19；修回日期：2018-7-29

编辑/杨倩