静电场辅助作用对明胶分子结构转化的影响

邢建宇，申 宇，冯冬冬

(1.长安大学环境科学与工程学院，陕西西安710054；2.长安大学旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西西安710054)

明胶是胶原蛋白水解后的产物，因其具有原料易得、制备工艺简单、生物可降解性强及生物兼容性好等特点，使得明胶广泛应用于食品、医药和组织工程材料等多个领域[1-3]。但是以往的研究及应用主要集中于利用明胶生物降解性强、生物兼容性好的特点，而对于明胶在使用过程中的结构变化以及由此对于合成材料整体上理化性质的影响关注较少。

明胶的变性温度约为35 ℃，其无规则卷曲转变为螺旋结构的过程可分为两个阶段，当冷却开始时，螺旋结构的形成速率较快，持续几分钟，然后进入一个较长的慢速率时期，最终达到胶原状态的平衡。与其他具有螺旋结构的生物多聚体(如，多糖、DNA等)相比，明胶的复性速率相对较慢，这主要是由于大量存在的肽键需要高的活化能(约72 kJ/mol)进行顺反异构反应以形成三螺旋结构[4]。当高于变性温度的明胶无规则卷曲被冷却时，部分的明胶链可以复性到螺旋状态及三螺旋状态，但是复性的程度取决于很多因素，如浓度、温度、压力、溶剂以及有无化学交联剂[5-8]。Gandhi等[9]研究发现，在搅拌的条件下，高于变性温度存在的明胶无规则卷曲，可部分复性为螺旋结构，因此在体积上呈现大的差异，并将该种复性归结于搅拌条件下明胶链的伸展与定向排列。除了复性带来的体积上的变化外，明胶复性还会带来其力学性能方面的提高，影响其在生物材料中的应用[10]。

α-螺旋多肽的生物学功能主要是由分子轴上大的宏观偶极矩(每个氨基酸残基的偶极矩大约为11.669×10-30C·m)引起的，而且偶极产生静电场，并在氨基端产生正电荷、在羧基端产生负电荷。α-螺旋多肽大偶极距在生物体系中蛋白质的结构和功能方面起着非常重要的作用。目前在很多非等轴材料研究中，已经将注意力集中在有助于分子排列调节的静电作用上[14]。研究结果表明，外加静电场的存在，确实有助于α-螺旋多肽分子的排列，对于电场中的多肽分子具有一定的导向作用[15-17]。但是，目前的研究主要集中在采用接触式电场作用的影响，即通过电极表面多肽片段的排列来考察电场的影响，鉴于非接触式静电场在果蔬保藏方面的应用[18]，可以预见，在明胶溶液两端施加非接触式静电场，将有助于明胶多肽分子微观结构的伸展，对明胶的卷曲-螺旋结构转化起到积极的辅助作用。

本文中，笔者拟在非接触式静电场的作用下研究明胶的螺旋-卷曲转化，通过电场强度与浓度、温度和溶剂的协同作用，考察电场作用对于明胶卷曲-螺旋变化的辅助作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

明胶(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙二醇(分析纯)，天津市化学试剂六厂；WXG-4 型旋光仪，西安精科有限公司；DYY-6B型稳压稳流电源，北京六一仪器厂。实验中所用的水均为美国Millipore公司生产纯水仪所制的标准为18.2 Ω去离子水。

1.2 实验方法

图1为静电场的构建示意图。通过将8 cm×8 cm两块铜片平行放置，间距6 cm，并在铜片上施加电压来实现。使用水及乙二醇溶液配制不同浓度明胶溶液，置于静电场环境中，分别施加100、250和500 V电压(对应电场强度分别为1 667、4 167和8 333 V/m)，测试并考察溶液旋光度的变化，明胶的结构改变会引起整体明胶溶液旋光度的改变，采用比旋光度法可测定明胶溶液中分子结构转变[19]，每组实验均做3个平行，最终数据取平均值。

比旋光度的计算公式为：[α]=α/Lρ。 其中，α为测得的旋光度(°)，L为溶液长度(dm)，ρ为溶液的质量浓度(g/mL)。

图1 非接触式静电场的构建示意Fig.1 Diagram of non-contact electrostatic field construction

2 结果与讨论

2.1 电场对明胶溶液卷曲-螺旋转化的辅助作用

明胶溶液中螺旋组分的含量与溶液中旋光度成正比关系，且由于明胶为左旋化合物，故旋光度为负值。考察电场对明胶溶液卷曲-螺旋转化的辅助作用，结果见图2。由图2可知，静电场对室温及冰浴条件下的明胶溶液均有不同程度的辅助作用。在室温条件下，4 mg/mL明胶溶液的旋光度随着时间的延长而增大，并在10 min以后趋于平衡。而平衡时的旋光度与电场强度关系密切，其数值随着电场强度的升高而升高。冰浴条件下，由于温度的降低，明胶溶液的旋光度数值变化很大，增幅约为17.25倍，远高于常温下8 333 V/m的静电场对明胶的复性辅助作用。在冰浴的基础上，电场的辅助作用更为明显。冰浴条件下(图2(b))，当电场强度1 667 V/m时，旋光度的数值有约30%的升高，而后随着电场强度的升高，旋光度值趋于稳定；当电场强度为4 167 V/m和8 333 V/m时，电场强度对明胶卷曲-螺旋转化的辅助作用达到极限。

图2 静电场对明胶溶液旋光性的影响Fig.2 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin solution

2.2 静电场对不同浓度明胶结构转化的影响

考察电场强度对不同质量浓度(1、2、4和8 mg/mL)明胶结构转化的影响，结果见图3。从图3可以看出：明胶溶液质量浓度为1 mg/mL时，溶液比旋光度受电场影响最大，说明此时单分子明胶的伸展由于受到电场的引导，从无规则卷曲结构达到伸展状态，而随着浓度的增加，明胶分子间作用力增强，电场的辅助作用依次减小，当质量浓度达到8 mg/mL时，比旋光度略有上升，此时可能由于浓度较大，明胶溶液中分子数量巨大，而并非由于电场的辅助作用引起的明胶结构改变导致的。

图3 电场强度对不同浓度明胶结构转化的影响Fig.3 Effects of electric field intensity on gelatin with different concentration

图4 冰浴条件下静电场对不同明胶浓度 明胶旋光性的影响Fig.4 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with different concentration in ice-bath

明胶溶液的旋光度变化与浓度、电场强度及温度均相关。在冰浴条件下，考察电场强度对不同质量浓度(1、2、4和8 mg/mL)的明胶结构转化的影响，结果见图4。由图4可知：电场引起的旋光度增量随着浓度的升高也降低了约4.7倍。此结果表明，高浓度明胶溶液不利于明胶分子的伸展，所以无规则卷曲状态向α-螺旋状态的转化受到抑制。已有的研究结果表明[17]，浓度不同的明胶溶液遵循不同的复性速率，稀溶液中，符合一级动力学模型，此时的复性机制可能主要为单链分子内的折叠复性，复性的速率与浓度无关。高浓度时，明胶分子的复性则复杂得多，不仅涉及分子内的折叠复性，还涉及分子间的相互作用，此时复性的过程是与浓度相关的。在冰浴条件下，静电场的辅助作用对于低质量浓度明胶溶液(0.5 mg/mL)更加明显，在冰浴条件下，8 333 V/m的电场强度对于0.5 mg/mL的复性增幅约为8 mg/mL条件下的5倍。

2.3 乙二醇溶液中电场强度对低浓度明胶的影响

乙二醇的添加，不仅会增大溶液体系的黏度，还可通过氢键作用维持明胶的构象。考察乙二醇溶液中电场强度对低浓度(1 mg/mL)明胶的影响，结果见图5。由图5可知：常温下，当明胶质量浓度为1 mg/mL时，乙二醇体积分数的改变几乎对明胶的复性行为没有影响。但是当处于冰浴状态下时，电场的辅助行为明显升高，且电场的电场强度越大，变化的幅度越大。而乙二醇体积分数的升高，有利于通过肽-肽氢键作用维持已复性的螺旋结构[19]，故溶液旋光度的变化也依次升高。

图5 乙二醇溶液中电场强度对低浓度明胶的影响Fig.5 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with low concentration in glycol solution

2.4 乙二醇溶液中电场强度对高浓度明胶的影响

考察乙二醇溶液中电场强度对高浓度(4 mg/mL)明胶的影响，结果见图6。由图6可知：当明胶质量浓度较高时，此时，明胶分子间较为拥挤，明胶的复性不仅涉及到分子内作用力，还涉及到分子间作用力，高浓度的明胶溶液不利于明胶分子的伸展，所以电场的导向牵引作用不易引起明胶分子的复性，电场辅助作用在常温及冰浴条件下带来的变化都不大。此时，乙二醇的体积分数变化对于明胶的复性维持作用同样影响不大，并且明胶的复性作用与乙二醇的浓度并不呈线性关系，当乙二醇体积分数为50%时，电场引起的复性作用略高一些。

图6 乙二醇溶液中电场强度对高浓度明胶的影响Fig.6 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with high concentration in glycol solution

3 结论

考察了静电场对明胶结构转化的影响，发现静电场对明胶的卷曲-螺旋转化随着电场强度的升高而逐渐增强，随着明胶浓度的增加而降低，且降低的程度与明胶分子间作用力关系密切。通过对溶剂的研究发现，电场作用对明胶的复性作用与溶剂有很大关系，低明胶浓度时，尤其是冰浴条件下，升高乙二醇体积分数有助于明胶的复性，而高浓度时，电场引起的辅助作用并不明显，溶剂的影响也不明显。