茶多酚联合顺铂对肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响

2018-10-11 07:04王若石蔡钧
中国现代医学杂志 2018年28期
关键词:增殖率空白对照肺癌

王若石,蔡钧

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 急诊创伤外科,湖北 武汉 430030)

肺癌是发病率最高的恶性肿瘤之一,目前居我国恶性肿瘤发病率的第一位[1],肺癌的治疗主要包括手术、放疗、化疗及分子靶向治疗。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)常用的化疗药是顺铂(Cisplatin, DDP),一种细胞周期非特异性细胞毒药物,主要通过干扰肿瘤细胞的DNA复制达到抗肿瘤效果,并且与给药浓度呈正相关,但同时毒性作用也会增加[2-3]。此外,顺铂治疗肺癌产生耐药的研究时有报道[4],因此有必要寻找降低毒副作用、提高治疗效果的联合用药方案。

茶多酚(tea ployphenols, TP),其是一类多羟基酚类化合物,普遍存在于茶叶中,目前学术界对它的研究较多,文献报道其有化疗增敏、抑制肿瘤细胞生长、减轻化疗药的毒副作用的功效[5-6]。但茶多酚在肺癌中的报道较少,因此本研究在体外采用TP与DDP联合作用于肺癌细胞,以阐明其对肺癌细胞增殖和凋亡能力的作用和影响,探讨其对DDP抗肿瘤疗效的增敏作用,并初步探讨其作用机制,以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人肺癌细胞系A549购自北京协和医学院实验医学中心,RPMI-1640培养基及胰酶均购自美国Invitrogen公司,MTT试剂盒、二甲亚砜(DMSO)购自美国Invitrogen公司,AnnexinV/PI双染试剂盒购自南京博泰生物科技有限公司,p-AKT、p-ERK1/2、AKT、ERK1/2抗体购自美国Cell signaling technology公司,HRP标记羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG均购于上海碧云天生物技术研究所,离心机购自日本久保田公司,超净工作台购自江苏苏净集团,生化床购自苏州威尔实验用品公司,电泳仪、电转仪购自北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 结合临床及预实验结果,TP和DDP给药浓度分别选择10和5 μg/ml,实验分为TP组、DDP组、TP联合DDP组(TP+DDP组)及空白对照组,空白对照组仅加入等量溶媒。

1.2.2 细胞培养 将人肺癌细胞系A549细胞,于37℃、5%二氧化碳CO2的条件下,加入RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)中,置于培养箱中培养,待细胞长至融合后,胰酶消化细胞,并待细胞长至对数期时加入药物行相关实验。

1.2.3 MTT实验 细胞增殖率的检测采用MTT法,选取对数生长期的细胞,接种于96孔板,按每孔5×103个的数量接种,每孔100μl。培养条件为:37℃、5%CO2,细胞培养生长至70%,按分组要求给予不同处理药物,每组设5个复孔。药物作用24 h后,每孔加入5 g/L MTT 20μl,继续培养4 h,弃去培养液,每孔按150μl的量加入DMSO,在室温条件下,震荡10 min,在570 nm处用酶标仪检测4组细胞的吸光度值(OD值)。细胞增殖率=处理组OD值/对照组OD值×100%。每组实验重复3次。

1.2.4 细胞凋亡检测 细胞凋亡率的检测采用流式细胞术,将TP组、DDP组、TP+DDP组及空白对照组4组细胞以每孔5×105个接种于12孔板,在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h后,收集细胞,4℃离心5 min(1500 r/min),弃上清。用500μl PBS溶液重悬细胞并计数,取1×106个细胞数,加入5μl AnnexinV-FITC并混匀,加入5μl PI并混匀,在2~8℃避光孵育15 min,冰浴避光保存,1 h内使用流式细胞仪进行检测,每组实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测 采用 Western blot检测p-ERK1/2、p-AKT蛋白的相对表达,裂解4组细胞后,提取4组细胞总蛋白,测定4组蛋白浓度后,定量,上样,以50μg/孔的标准上样,常规湿法转膜,条件:浓缩胶60 mA 50 min、分离胶120 mA 1 min,将凝胶内蛋白转至PVDF膜上,放入含50 g/L脱脂奶粉的溶液中封闭1 h,加入p-ERK1/2、p-AKT、GAPDH一抗,浓度为1︰200,在4℃条件下孵育过夜,TBST洗膜3次,每次10 min,加入相应的HRP标记的羊抗兔IgG(1︰1000)或HRP标记的羊抗鼠IgG(1︰1000),室温孵育2 h,TBST洗膜3次,用ECL化学发光液在凝胶成像仪中显色,采用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析,以p-AKT、p-ERK1/2分别与AKT、ERK1/2条带灰度的比值表示目的蛋白的相对表达。

1.3 统计学方法

数据分析均采用SPSS 17.0统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间的比较采用单因素方差分析,差异有统计学意义时,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组A549细胞增殖率比较

MTT示:TP组增殖率为(91.0±3.6)%,DDP组增殖率为(84.3±5.0)%,TP+DDP组增殖率为(70.3±4.2)%,空白对照组增殖率为100%,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=84.47,P=0.000),TP组、DDP组及TP+DDP组增殖率均低于空白对照组;TP+DDP组细胞增殖率与DDP组比较,经LSD-t检验,差异有统计学意义(t=2.398,P=0.002),TP+DDP组低于DDP组(见图1)。培养第2天开始DDP对细胞A549有抑制作用,且随着作用时间的延长,生长曲线下降逐渐明显,TP+DDP组生长曲线下降较DDP组更为明显,两者差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图1 TP、DDP及两者联用对细胞A549增殖的影响

2.2 各组细胞凋亡率比较

流式细胞术所示,空白对照组总凋亡率为(7.86±0.34)%,DDP组总凋亡率为(18.78±0.62)%,TP组总凋亡率为(5.85±0.41)%,TP+DDP组为(26.46±0.45)%,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=102.93,P=0.000);DDP组和TP+DDP组总凋亡率与空白对照组比较,经LSD-t检验,差异有统计学意义(P<0.05),TP+DDP组细胞凋亡率高于TP组(t=8.398,P=0.015),TP组与空白对照组凋亡率差异无统计学意义(t=5.839,P=0.265)。见图3。

图2 TP、DDP及两者联合作用下A549细胞的生长曲线

2.3 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达变化

空白对照组p-AKT蛋白相对表达为(1.0±0.03),TP 组为(1.0±0.04),DDP 组为(0.79±0.06),TP+DDP组为(0.68±0.02),经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=25.12,P=0.000);DDP组p-AKT蛋白相对表达与空白对照组比较,经LSD-t检验,差异有统计学意义(t=-5.422,P=0.005),DDP组低于空白对照组;TP+DDP组p-AKT蛋白相对表达与空白对照组比较,经LSD-t检验,差异有统计学意义(t=-15.372,P=0.000),TP+DDP组低于空白对照组。见图4。

空白对照组p-ERK1/2蛋白相对表达为(1.0±0.02),TP 组为(0.98±0.04),DDP 组为(0.82±0.05),TP+DDP 组为(0.65±0.05),经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=35.970,P=0.000);DDP组p-ERK1/2蛋白相对表达与空白对照组比较,经LSD-t检验,差异有统计学意义(t=-5.789,P=0.004),DDP组低于对照组;经LSD-t检验,TP+DDP组p-ERK1/2蛋白相对表达与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=-11.257,P=0.000),TP+DDP组低于空白对照组。见图4。

图4 TP、DDP及两者联用对A549细胞p-ERK1/2及p-AKT蛋白表达的影响

3 讨论

顺铂是治疗非小细胞肺癌的重要药物,单药有效率为16%~20%,通常与紫杉醇或长春瑞滨联用作为标准一线化疗方案[7-8]。但抗肿瘤的化疗药副作用大,引起诸多不良反应,诸如:脱发、骨髓抑制、肝肾毒性及胃肠道反应等,而且长期使用容易导致耐药性发生,进而引起肿瘤复发或转移等[9],如何减轻化疗药物的毒性,并增强化疗药物疗效成为了肿瘤研究人员关注的热点。

TP作为一种无毒性作用的天然植物提取物,有研究报道,其有一定的抗肿瘤作用,少量的茶多酚作用于前列腺癌、乳腺癌及肺癌细胞可诱导其发生凋亡[10-12]。本研究发现,低剂量TP作用于A549细胞未能引起细胞凋亡,然而与DDP联用却可以增加A549细胞的凋亡率。细胞凋亡是细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发性死亡过程,在细胞凋亡过程中,半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族发挥着重要的作用,凋亡信号转导过程被启动后,半胱氨酸蛋白酶8(Caspase-8)可由酶原变成具有活性的蛋白,并诱导凋亡级联反应发生,半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是细胞凋亡性死亡的最终执行者,它最终被活化为裂解型Caspase-3,能够直接裂解多个重要的结构与功能蛋白[13-14]。

细胞凋亡过程可分为3个阶段,即起始阶段、效应阶段和凋亡执行阶段,机体内存在多种因素影响着细胞凋亡的过程。

丝裂素活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)在信号转导过程中的作用越来越受到关注,它可以调节细胞各种生理过程,包括炎症、应激、生长发育、分化与死亡[15]。MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(JNK)、p38蛋白和细胞外信号调节激酶5(ERK5)途径,其中ERK通路在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要作用,它可在上游因子MEK的作用下发生磷酸化而激活[16-17]。

ERK通路与PI3K/AKT通路存在密切的联系,ZHANG等[18]证明ERK通路与AKT通路有交互作用,他们发现抑制Hela细胞ERK的活化,可引起mTOR的激活,而PI3K/AKT信号通路的激活可阻断该过程所致mTOR的活化。PI3K信号通路可调控着诸如细胞凋亡、分裂、分化等多种生物学过程。丝氨酸/苏氨酸AKT,又称蛋白激酶B,为其直接靶作用蛋白,可诱导细胞增殖和凋亡的发生。在PI3K的作用下,AKT发生磷酸化而被激活,从而作用于多种底物来调节细胞的生存、增殖和代谢[19]。

本研究发现在肺癌细胞A549中,TP与DDP联合后可显著增强DDP的抗肿瘤效应,MTT法检测结果显示DDP组的细胞活力为(84.3±5.0)%,而TP+DDP组的细胞活力仅为(70.3±4.2)%,差异有统计学意义,TP组的细胞增殖仅有轻度抑制,因此TP与DDP联合可明显提高DDP对细胞A549增殖的抑制作用。流式细胞术测定凋亡发现,TP对细胞凋亡作用不明显,无显著影响。DDP组与空白对照组比较,细胞凋亡率升高,而TP+DDP组细胞凋亡率高于TP组,说明TP可促进DDP对肺癌细胞A549的毒性作用。Western blot检测AKT和ERK1/2的磷酸化水平发现,DDP组与TP+DDP组细胞中p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达均降低,并且TP+DDP组细胞中p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达低于DDP组,而TP组对p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达均无明显影响。

综合以上结果,说明DDP可抑制A549细胞增殖,并且可引起细胞凋亡,但低剂量TP对A549细胞的增殖仅有轻微抑制作用,并且对细胞凋亡无明显影响,而TP与DDP联合应用却可使细胞增殖率大幅降低,并使细胞凋亡率明显升高,同时TP与DDP联用对ERK1/2和AKT蛋白磷酸化的抑制作用也明显增加,说明TP可增强DDP的抗肿瘤作用,其机制可能与抑制AKT和ERK1/2蛋白磷酸化有关。

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